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Transgenese1 2010 Students .pdf



Nom original: Transgenese1_2010_Students__.pdf
Titre: Microsoft PowerPoint - Transgenese for Students 2010 .ppt
Auteur: roder

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Transgenèse chez la drosophile

Bilan Discussion premier cours 2010 :
L’élement transposable de drosophile P modifié est utilisé comme vecteur de transformation de la lignée germinale de
la droso pour la création de lignées transgéniques de drosophile.- Il existe des constantes pour réaliser une lignée
transgénique : apport de transposase + vecteur de transfo contenant au moins les Pieds de P5’ et 3’ entourant un marqueur
de transformation permettant de repérer les individus transgéniques parmi ceux qui ne le sont pas et une séquence d’intérêt :
la « boite orange » sur le schéma. En fonction de la question que l’on se pose la « boite orange » est différente…
Ex détecter des gènes sur la base de leur profil ou patron (pattern) d’expression spatio- temporel=
Réaliser l’insertion au hasard dans tout le génome d’un vecteur de transformation pour lequel La
boite orange est constituée d’un promoteur minimum (par ex hsp70) et aval la séquence codant un
rapporteur (ex beta-galactosidase) = enhancer trap (piège à enhancer) . Le principe : en fonction
de l’endroit dans le génome où il est inséré l’élément enhancer trap piéger un élément activateur
de la régulation de la transcription d’un gène endogène qui va réguler l’expression, la transcription
plus précisément ,du gène rapporteur comme il le fait pour le gène endogène.
Identification du gène piégé par plasmid rescue par exemple dans la mesure où le vecteur
de transformation a été construit en incluant entre les pieds de P une séquence bactérienne avec
Ori gine de Réplication et gene de resistance à un antibiotique .
Ex détecter le profil d’expression d’une protéine ( pattern de traduction )- identifier la dynamique du profil
d’expression d’une protéine-identifier des marqueurs cellulaires/tissulaires/ ou des marqueurs
subcellulaires : idem mais avec un autre vecteur de transformation = Protein trap. La boite orange
est dans ce cas celle qui est indiquée dans le shéma du poly.
Identification du gène piégé par PCR inverse = ampli d’une séquence ADN génomique
flaquant l’ élément transposable. Etapes: -digestion ADN génomique par 1 enzyme de restriction –
circularisation des séquences plasmidique+ADN génomique par Ligation –Amplification avec des
oligos spécifiques des séquences plamidiques internes (qui sont connues!) cf Schéma Principe de
la PCR inverse.
Etude de la fonction d’un gène avec le système GAL4-UAS :-surexpression et/ou expression ectopique d’une forme sauvage ou
mutatnte d’une séqence codante d’intérêt (Gain of function) : important pour obtenir des données fonctionnelles sur un gène ; 60%
des genes de droso ne donnent pas de phenotype perte de fonction) -inhibition de l’expression d’un gène (Loss of
function): permet de déterminer si un gène est nécessaire, important dans un processus donné? l’ARN interférence grâce a
un ARN double brin (dsARN) spécifique d’un messager (DICER_RISC_voie de clivage de l’ARNm cible)

Protein trap : « A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci
in Drosophila » (2001) PNAS 98:15050–15055.
>information obtenue au niveau de la protéine
>dynamique de la distribution de la protéine dans l’organisme entier en vie
>obtention de marqueurs pour de nombreuses cellulaires et compartiments subcellulaires
Protein Trap Transposon (PTT):

Exon artificiel codant une GFP sans codon d’initiation ni codon stop et flanqué
d’un site donneur (SD) et d’un site accepteur (SA) d’épissage

Protéine chimère fluorescente
http://flytrap.med.yale.edu/

noyau

Architecture nucléaire:
chromatine, nucléole,
domaines extra
chromosomiques, Lamina
nucléaire

cytoplasme

membrane

Protéines
associées aux
microtubules :
Ch métaphase,
centrosomes

Axones

Matrice extra cellulaire
(collagene type IV ,
Viking)

muscles
sarcomères

Analyse clonale et création d’animaux mosaïques
Clone :

ensemble de cellules de même génotype dérivant d'une seule cellule initiale par mitoses
successives, au sein d’un individu de génotype différent .

Animal mosaïque :

Clone(s) de cellules homozygotes m/m au sein d’un animal hétérozygote m/+
Clones Somatiques Clones germinaux

Conditions:
-induction de recombinaisons dans des cellules en mitoses : recombinaison mitotique
ex de stratégie: recombinaison mitotique site spécifique avec le système FRT/FLP
-reconnaissance du clone
Principalement utilisée pour:
-Analyse fonctionnelle d’une mutation maternelle et/ou zygotique récessive létale
(gène maternel =fonctionnel pendant l’ovogenèse dans la lignée germinale ou somatique)
-Détermination de l’ expression autonome cellulaire ou non d’un gène
-lignage cellulaire (nombre et destinée des cellules issues d’une cellule d’origine par divisions
mitotiques successives)

Rappel:

Division cellulaire

INTERPHASE (G1/S/G2) MITOSE INTERPHASE MITOSE INTERPHASE MITOSE ………………

INTERPHASE

….

PROPHASE

METAPHASE

Condensation chromosomes

Alignement des chromosomes
sur la plaque équatoriale

Chromosomes
homologues

*

Centromère

* *+

………

TELOPHASE….
PROPHASE
CYTODYERESE…

+

Chromatides sœurs

Cellule mère
m/+

*
*

+

*

+
+

*

*+ +

+

2 Cellules filles
m/+

* *+

+

Divisions
cellulaires

Système FLP/FRT et RECOMBINAISON MITOTIQUE SITE SPECIFIQUE :
Dans des cellules en mitoses, la recombinase (FLP) reconnait et induit la recombinaison spécifique
entre deux séquences FRT (FLP Recombinase Target).
PROPHASE
INTERPHASE

+

Divisions
cellulaires

+

Clone +/+

+ ++ +

50%

+

+

*

*

Clone m/m

PROPHASE

*

*

* ** *
FRT

*

*+ +

Clone m/+

*

Génotype:

m/+; hs-FLP/+

+* +
+

+ +*

50%
+

*

*

+

*

Clone m/+

*
Modified from C Zaffran L3 genetic lecture

*

+

* *+

+

Reconnaissance des clones : association d’un marqueur de recombinaison
Identification négative: clone m/m identifié par la perte d’un marqueur
Ex : GFP sous contrôle d’un promoteur ubiquitaire (UB-GFP)

+

cellules m/+

Clone +/+

+

FRT UB-GFP, +/ FRT UB-GFP, +; hs-FLP / +
+

UB-GFP

FRT

+
m

m

FRT UB-GFP,+/ FRT m,+; hs-FLP / +
m

Clone m/m

m

FRT m,+ / FRT m,+; hs-FLP / +

Exemple:

Identification of mutations that cause cell migration
defects in mosaic clones
(1999) Yuru Liu and Denise J. Montell, Development 126, 1869-1878

-Follicle cell migration during drosophila oogenesis as model
-Why a clonal analysis?
Because mutations that perturbs
follicle cell migration also cause lethality during early development

Identification of mutations that cause cell migration defects in mosaic clones………….

Strategy:
Tissue-specific expression of the site specific recombinase FLP to
clones of lethal mutations in the follicle cells of the ovary (somatic cells)

create mosaic

Some data about drosophila oogenesis……..

Fly (3mm)

Appareil génital :

Egg (0.5mm)

Paire d’ovaires constitués de 16-20 ovarioles
Une ovariole est constituée d’une succession de
chambre ovariennes à différents stades de
développement

Germarium:
Germ line
stem cells

Germarium
Stage 1

1

2a
Somatic
stem cells

2b

Stage 2

Immunodetection
Confocal microscopy

Stage 4

In red:

(Specialized
Follicle cells)

Stage 7
stage 1

3
Follicle
cells
Nurse cells

Stage 9

Oocyte

Notes:
Germline cells:
Nurse cells: 15 cells
Endoreplication* 1024c
(*replication DNA without cytokinesis)
Ovocyte :
1 cell
meiosis/ c
Somatic cells:
Follicle cells:1100 cells
mitosis/ 2c

Ovariole et chambres ovariennes
Dend and Bownes(1998)Int.J. Dev.Biol 42:541-552
Van Buskirk et al(2000)Development 127:4753-4762 (* Protéine ENCORE)

Stage 10

Actin

In green: a
cytoplasmic protein
expressed in all germ
line cells and which
accumulates in the
oocyte*

follicle cell migrations...
Ovocyte
monolayer epithelium
of Follicle cells
(cuboidal shape)

90% of follicle cells change
into columnar shape and move to
the posterior half of the egg
chamber.
The remaining follicle cells
become thin and flat and strech
to
cover
the
nurse
cells
(stretched cells)

A
Nurse cells

B

C

From DENG and BOWNES Int.J. Dev.Biol(1998)42:541-552

Identification of mutations that cause cell migration defects in mosaic clones………….
Strategy:
Tissue-specific expression of the site specific recombinase FLP to create mosaic clones of
lethal mutations in the follicle cells of the ovary
Genetic tools:
-Enhancer trap lines:

PZ6356 :b-gal expression in border cells and the oocyte
no detectable homozygous phenotype

The PZ6356 enhancer trap line :
β-gal staining of WT border cells and oocyte (blue staining)
A) The border cells (6-10 cells) undergo a fairly typical epithelial to mesenchyme transition
B) They extend cytoplasmic extensions between 2 nurse cells
C) They migrate approximately 150µm and the complete migration take 5 hours

Mid stage 9

filopodia

Actin in red

ADN in blue

Identification of mutations that cause cell migration defects in mosaic clones………….
Strategy:
Tissue-specific expression of the site specific recombinase FLP to create mosaic clones of
lethal mutations in the follicle cells of the ovary
Genetic tools:
-Enhancer trap lines:

PZ6356 :b-gal expression in border cells and the oocyte
no detectable homozygous phenotype

PZ2970 : b-galactosidase expression in all follicle cells
PZ3050 :b-gal expression in the border cells and centripetal follicle cells
-Transgenic line :
FRT PZ6356 / FRT T155-GAL4, UAS-FLP
T155-GAL4, UAS-FLP in cis with the FRT :
T155 drive the expression of Gal4 early during oogenesis in follicle cells precursors
Enhancer trap element PZ6356 in cis with the FRT

Expression pattern of T155 –GAL4 visualized with UAS-GFP:
T155-GAL4/UAS-GFP line

Region II of
the
germarium

contains
Follicle cell
precursors!

TEST: Follicle cell clones produced by the FRT/FLP system.
PZ2970/CyO enhancer trap line

β-Gal staining : All follicle nuclei

PZ3050/CyO enhancer trap line

FRT PZ2970 / FRT T155–GAL4, UAS-FLP

Clone detection: absence of β-Gal staining
- 80% of egg chambers contains clones
- Clone size: 300-700 cells
FRT PZ3050 / FRT T155–GAL4, UAS-FLP

centripetal cells

Border cells

β-Gal staining : Border and centripetal
follicle nuclei

Clone detection: absence of β-Gal staining
- 20% of clones includes border cells

Screen for mutations affecting border cell migration in mosaic clones

* : Mutagenized chromosome
X : mitotic recombinaition between 2 FRT sites
T155-GAL4 and UAS-FLP transgenes on the thrird chomosome >>>>> Recombination in the fc precursors

X

Ovaries from two females were
-dissected
- stained for β-Gal activity
- analyzed for defects in border cell
migration

If a defect in border cell migration observed:
males of dp,PZ6356, FRT2R,*/FRT2R; T155UF/+ genotype mated with ScO/CyO;ry virgin females
and balanced stocks established.

20 mutant lines : classes based on border cell migration defects similarity
early stage 10
WT

extent of outer
follicle cell rearrangement.

border cells

Class I (5 alleles): no initiation of migration
reduced β Gal expression

oocyte
nucleus

Class II (10 alleles): no initiation of migration - β Gal
expression normal level

Class IV(1 allele): increased number of border cells ~migration between nurse cells

Class III (3 alleles): mid
delay of migration - β Gal
expression normal level

Class V(1 allele): defects in final border cell positionmislocalization oocyte/degenerating nurse cells

Reconnaissance des clones : association de marqueur de recombinaison

Identification positive: clone m/m identifié par la présence d’un marqueur
Ex : myc-tag

Clone +/+

+

cellules m/+
+

+

m

hs-FLP; FRT +, + / FRT

+, +

FRT

+

myc-tag

m

myc-tag

m

myc-tag

hs-FLP; FRT m mycTag / FRT +, +

Clone m/m
hs-FLP; FRT m mycTag / FRT m mycTag

Exemple:
Comment Ras régule croissance et prolifération in vivo????
Modèle: Cellules des disques imaginaux de drosophile
Stratégie: analyse de clones mitotiques dans le disque imaginal d’aile
hs-FLP ; FRT rasc40b mycTag / FRT , +, + ; en-GAL4, UAS-P35
rasc40b: mutation perte de fonction (loss of function, lof) de rasGTPase (cell
proliferation/apoptosis)
mycTag : marqueur de recombinaison
en-Gal4 : engrailed –GAL4 : expression de GAL4 dans compartiment postérieur
UAS-P35: P35 est un inhibiteur de caspase ; abolit apoptose

Immunodétection anticorps anti-mycTag couplé à la GFP
D. Prober, B. Edgar “ Ras1 Promotes Cellular Growth in the Drosophila Wing”. Cell (2000) 100: 435-446.

Le disque imaginal:
précurseur des
structures adultes
…….
Quelques données
supplémentaires

L1

L2

Cluster of 16-30 cells
in embryonic
ectoderm : Distal-less (Dll) is the first
genetic signal for « limb » formation
(antennae,labium, legs and wings) .

w h

Germ band retracted embryo (late stage 12) :
- The leg primordia in the thoracic segments (t1-t3)
are labelled by Distal-less.
- The primordia of the wing (W) and haltere (h) discs
express Vestigial .

From Cohen et al (1993) Development 117, 597-608.

4j

2j

1j

1j

1j
Embryo

Metamorphosis:
Differentiation
Evagination

Larval stages:
Division and Growth

Embryogenesis:
determination of
imaginal discs
primordia

L3

Pupa

L3 wing disc:
~50000 cells

Epidermal
structures of
adult head,
thorax and
terminalia

Adult

hs-FLP ; FRT rasc40b mycTag / FRT , +, + ; en-GAL4, UAS-P35
Primordium wing disc
~50 cells

L1

24h

4j

2j

1j

1j

1j
Embryo

L3 wing disc
50 000 cells

L2

L3

48h

72h

Induction mitotic clones:

Pupa

96h

Adult

120h

Analysis

Induction FLP
Heat Shock
24h post Induction

48h post Induction

72h post Induction

25°C

216h After Egg Deposition

compartiment antérieur

compartiment postérieur

Identification positive: clone m/m identifié par la présence d’un marqueur

Sytème MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)

m
m
m

FLP

hs-FLP; FRT UAS-mcd8 GFP, driver – GAL4, m
FRT, tubP-GAL80 , +

Homozygous mutant
uniquely labeled

m
hs-FLP; FRT UAS-mcd8 GFP, driver – GAL4, m

FRT, UAS-mcd8 GFP, driver – GAL4, m

hs-FLP; FRT, tubP-GAL80 , +
FRT, tubP-GAL80 , +

La cellule mère est hétérozygote pour le transgène GAL80. La protéine GAL80 est exprimée ubiquitairement sous le contrôle du
promoteur de la tubuline (tubP-GAL80). GAL80 est un represseur de la transcription; GAL80 (en rose) se lie à l’activateur GAL4 au site
UAS et inhibe la transcription du gène rapporteur (UAS-marker) dépendante de GAL4. Après recombinaison mitotique, le transgène
GAL80 est éliminé dans une des deux cellules filles, permettant ainsi l’activation spécifique de l’expression du gène rapporteur (UASmarker) par GAL4 dans cette cellule et sa descendance. Si une mutation (m) est localisée sur le bras de chromosome portant les
transgènes rapporteur et GAL4, seule la cellule fille homozygote m/m, qui ne possède plus le transgène tubP-GAL80, est repérable par
l’expression du gène rapporteur activée par GAL4.
Lee and Luo , 2001, Trends in Neurosciences 24:251

Utilisation du système MARCM: Lignage cellulaire/marquage individuel de cellule- Application au CNS

Utilisation du système MARCM: Analyse fonctionnelle de gènes-Application à la morphogenèse du CNS

exemple: Système EGUF/hid ( ey-GAL4/UAS-FLP/GMR-hid ) :

OK : L’absence/defauts de l’œil (aile..) chez l’adulte n’est pas létale!!!!!

8 photoreceptors and 18 non-neural support cells arranged in an invariant pattern.

R1 Photoreceptor cell
R1 Photoreceptor cell
rhabdomere (light-sensing
organelle, contain rhodopsin)

The morphogenetic furrow (mf) marks the passage of a wave of cellular differentiation
anterior

mf

posterior
Third instar eye-antennal imaginal disc, labeled with an antibody which
recognizes all the photoreceptor neurons (R1-R8)

Cellular differentiation initiates during the middle of the
third larval instar stage at the posterior edge of the eye
disc and sweeps across in an anterior direction, taking
approximately 2 days to traverse the entire field

antenna

eye

Gradient of photoreceptor recruitment and differentiation

EGUF/hid method
ey-GAL4 ,UAS-FLP ; FRT GMR-hid /FRT *
anterior

(mutation)

posterior

undifferentiated photoreceptor precursor field
Mitotic active eye precursor cells

differentiated photoreceptor precursor field

mf

ey-Gal4: expression de GAl4 dans
toutes les cellules indifférenciées

GMR-hid: expression de hid dans toutes les
cellules postérieures au sillon
morphogénétique

Schematic diagram of mitotic recombination occurring in eye precursor cells with the
EGUF/hid method

ey-GAL4 ,UAS-FLP ; FRT GMR-hid /FRT *

Photoreceptor neurons death
during pupal development

Photoreceptor neurons
Only */* photoreceptor neurons
formed the eye

Photoreceptor neurons death
during pupal development

(A) yw

(B) yw; FRT GMR-hid / +; ey-GAL4 ,UAS-FLP / + :
(C) yw; FRT GMR-hid / FRT +; ey-GAL4 ,UAS-FLP /+ :
(D) yw; FRT GMR-hid , CL /FRT +; ey-GAL4 ,UAS-FLP/+
CL = recessive cell lethal mutation

EGUF/hid test on lethal mutations in Synaptotagmin
synaptotagmin null mutations (sytAD4) die as embryos or paralyzed first instar larvae.
syt/syt mitotic clones phenotype?

(A) yw; FRT GMR-hid CL /FRT ; EGUF/+
(B) yw; FRT GMR-hid CL /FRT, sytAD4; EGUF/+

ElectroRetinoGrams from EGUF-hid recombinant eye flies.
(A) yw; EGUF/+
Normal synaptic transmission

on

Signature of normal
synaptic
transmission
off
light stimulation

(B) yw; FRT GMR-hid CL / FRT ; EGUF/+
Normal synaptic transmission

(C) yw; FRT GMR-hid CL / FRT sytAD4; EGUF/+

Defective synaptic transmission
of syt/syt ommatidies

(synaptotagmin)

EGUF/hid test on lethal mutations in Syntaxin
syntaxin (syx) : - required for membrane trafficking in several cell types
essential for synaptic vesicle fusion.
- required for cell viability

syx/syx mitotic clones phenotype?

(C) yw; FRT GMR-hid CL /FRT ; EGUF/+
(D) yw; FRT GMR-hid CL /FRT , syxL371; EGUF/+

Clones germinaux

Chou and Perrimon 1996 Genetics 144:1673


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