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Auteur: Emmanuelle Bouveret

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Stress
nutri*onnel
chez
les

bactéries:
la
réponse
stringente

E.
Bouveret

CNRS
–
LISM

bouveret@ibsm.cnrs‐mrs.fr

hEp://lism.cnrs‐mrs.fr/Bouveret


Plan
1.  The stringent response
2.  Rsh enzymes and (p)ppGpp metabolism
3.  Action of (p)ppGpp in the cell

Bacteria adaptation to their environment
Quality of the environment

Cellular resources
Growth/Reproduction

Maintenance/Survival

Nyström,
2004


Bacteria adaptation to starvation
Quality of the environment

Cellular resources
Growth/Reproduction

Rich medium

Cellular resources
Reproduction
Growth

Maintenance
Survival

Maintenance/Survival

Starvation

Cellular resources
Reproduction
Growth

Maintenance
Survival
Nyström,
2004


Bacteria adaptation to starvation
Quality of the environment

Cellular resources
Growth/Reproduction

Maintenance/Survival

Rich medium

Starvation

Stringent response
Cellular resources
Reproduction
Growth

Maintenance
Survival

Cellular resources
Reproduction
Growth

Maintenance
Survival
Nyström,
2004


Discovery of the stringent response
 rRNA quantification
c.p.m

Rich medium

Stable RNA synthesis

70000 ribosomes/cell
in rich medium

Amino acid
starvation
Relative Optical Density

2000 ribosomes/cell
during starvation

GROWTH

Stent
et
Brenner,
1961


rRNA synthesis inhibition is due to (p)ppGpp accumulation.

rRNA

ATP
_


P


5’


4’


_


‐


‐


_


ppGpp

N3


_


pppGpp
origin

5’

P


P

4’


1’

3’


2’


_


‐


_


‐


_


Magic
Spot II

_


Magic
Spot I

2’


_


GTP

1’

3’


_


Amino acid
starvation

Cashel
and
Gallant,
1969


N3


Cashel
and
Kalbacher,
1970


rRNA synthesis inhibition is due to (p)ppGpp accumulation.

rRNA

Amino acid
starvation

rRNA

Amino acid
starvation

Magic
Spot I
Magic
Spot II
No Magic Spot
Wild type

Relaxed
Cashel
and
Gallant,
1969


Stringent Response in E. coli
Starvation

(p)ppGpp
PrRNA
RNAp

stable RNA
synthesis

Ribosome biogenesis

Stringent Response in E. coli
Starvation
Membrane biogenesis
Phospholipid synthesis
fatty acid
synthesis

DnaA

(p)ppGpp

stable RNA
synthesis

Replication

Ribosome biogenesis

Stop Growth

σS factor

amino acid
biosynthesis

genes of stress
response

Activate Survival

Stringent Response in E. coli
Starvation
Membrane biogenesis

?

Phospholipid synthesis
fatty acid
synthesis

DnaA

(p)ppGpp

stable RNA
synthesis

Replication

Ribosome biogenesis

Stop Growth

σS factor

amino acid
biosynthesis

genes of stress
response

Activate Survival

Rsh proteins are involved in (p)ppGpp metabolism.
Starvation
GDP

Rsh

GTP

(p)ppGpp
degradation

PPi

ATP
(p)ppGpp Rsh
synthesis

ppGpp

pppGpp

AMP

(p)ppGpp

Stop Growth

Activate Survival

Identification des enzymes qui contrôlent le taux de (p)ppGpp.
approche génétique chez E. coli= les gènes rel (1965)
rRNA

Amino acid
starvation

rRNA

Amino acid
starvation

Magic Spot I
Magic Spot II
Wild type

No Magic Spot

Relaxed

•  Des mutants ‘relaxés’ ne font pas la réponse stringente: la synthèse
d’ARN continue pendant 1 heure après l’arrêt de la synthèse protéique.
•  Gènes relA, relC (L11), relB

relA code pour la (p)ppGpp synthétase I
•  Purification d’un « stringent factor » associé au ribosome
(1972-1975)
•  Clonage de relA: surproduction de ppGpp et ralentissement de la
croissance (1976)
=> démontre un effet direct du ppGpp sur la transcription
Synthèse

ARNr


Témoin


carence
en

acides
aminés

surexpression

de
RelA


Identification du gène spoT (1974)
•  Mutant spoT =accumulation de ppGpp= apparition d’un ‘spot’
•  spoT code pour une enzyme de dégradation du ppGpp
•  SpoT est une (p)ppGpp 3’-Pyrophosphohydrolase

ATP

GTP

ppGpp

pppGpp
origine
Souche
spoT-

Souche
spoT +

Laffler
et
Gallant,
1974


Identification d’une deuxième activité de synthèse:
(p)ppGpp synthase II
•  Dans un mutant relA, il y a toujours une activité résiduelle de
synthèse de (p)ppGpp (10 à 100 fois moindre)
•  Un autre gène…?
2
groupes
américains,
Cashel
et
Bremer,
en
1991

2
approches
géné*ques
différentes


IdenEficaEon
de
la
ppGpp
synthase
II

ppGpp


_


ppGpp:
pas
lacZ,
colonies
blanches

Sans
ppGpp:
lacZ,
colonies
bleues


P1rrnB

lacZ


Background
de
départ:
Souche
relA‐,
colonies
toujours
blanches
(ac*vité
de
synthèse
résiduelle)

Mutagenèse
aléatoire
=>
Recherche
de
colonies
très
bleues


=>
Gène
spoT

•  Donc, spoT code à la fois une activité (p)ppGpp 3’-pyrophosphohydrolase
et une activité ppGpp synthase II.

Hernandez
et
Bremer,
1991


Passage à la biologie moléculaire:
Rel/Spo homolog (Rsh) enzymes

Rsh

RelSpo

HD

(p)ppGpp
degradation

(p)ppGpp
synthesis

(p)ppGpp
synthesis
(p)ppGpp
degradation

N‐terminal
domain

Hogg
et
al.,
2004


ACT

TGS

regulation

Phylogenetic distribution of Rsh enzymes

+ SAS
RelSpo

TGS

HD

RelSpo

TGS

(p)ppGpp
degradation

(p)ppGpp
synthesis

RelA
SpoT

RelSpo

ACT

Rsh

HD

RelSpo

(p)ppGpp
degradation

(p)ppGpp
synthesis

TGS

ACT
regulation

Introduction (2)

Rsh proteins in E. coli

Amino acid
starvation

Carbon starvation

S

D

RelA

Growth

Phosphate
starvation

Iron starvation

S

SpoT

(p)ppGpp

Survival

Introduction (2)

RelA-dependent stringent response in E. coli
synthesis

RelA

N

1

regulation
C

386

739

Schreiber
et
al.,
1991


 Amino acid starvation:
Uncharged
tRNA

*

mRNA

Inactive
RelA

mRNA
GDP/GTP
(p)ppGpp

*
Active
RelA

*

Active
RelA

(p)ppGpp synthesis and accumulation
Wendrich
et
al.,
2002


Introduction (2)

SpoT

SpoT-dependent stringent response in E. coli

N

1

synthesis
degradation
344
85

regulation
357

C

203

702

Gentry
and
Cashel,
1996


Signal?

allosteric
transition
(p)ppGpp synthesis

(p)ppGpp degradation

Structure
of
the
N‐terminal
domain;
Hogg
et
al.
,2004


RelA and SpoT-dependent responses in E. coli
amino acid starvation

carbon, iron, or
phosphate starvation

Uncharged
tRNA

D

mRNA

TGS Cterm

SpoT

Cterm

RelA
S

S TGS Cterm
(p)ppGpp
Stringent response

?

Action du (p)ppGpp dans la bactérie
Starvation
Membrane biogenesis
Phospholipid synthesis
fatty acid
synthesis

DnaA

(p)ppGpp

stable RNA
synthesis

Replication

Ribosome biogenesis

Stop Growth

σS factor

amino acid
biosynthesis

genes of stress
response

Activate Survival

Le (p)ppGpp est un régulateur pléiotrope de la
transcription

Régulateur
posi*f
ou
néga*f
suivant
les
cibles.

Mode
d’ac*on
au
niveau
de
la
transcrip*on?
Modula*on
de
l’ac*vité
de
la
RNAP.


ArsEmovitch
et
al.,
2004


Action directe: le ppGpp inhibe la synthèse des ARN
stables et active la synthèse des acides aminés
A


Séquence

discriminatrice


InhibiEon


Séquence

discriminatrice


AcEvaEon


B


Paa

Transcrits


Srivatsan
et
al.,
2008


Opérons de synthèse des ARNr chez E. coli

Les
7
opérons
codant
pour
l'ARNr
d'E.Coli
s'appellent
rrnA
à
rrnG.
Ils
con*ennent
tous
3

ARNr
dans
l'ordre
16S,
23S
et
5S.
Tous
les
opérons
rrn
ont
2
promoteurs
:
P1
(promoteur

principal)
et
P2.
Entre
16S
et
23S,
on
a
une
séquence
codant
un
ARNt
dans
4
opérons
rrn
et

2
ARNt
pour
les
3
autres
opérons
rrn.
On
trouve
1
ou
2
ARNt
après
l'ARNr
5
S.


Mécanismes différents suivant les espèces

Absence
de
DksA

Inhibi*on
de
la
synthèse
de
GTP


Krasny
et
al.,
2004


Action indirecte: redistribution de la RNAP et implication
des facteurs de transcription alternatifs
Croissance


Prrn


Paa


Arrêt
de
la
Croissance


Facteurs
σ

alterna*fs


Prrn


Paa


Facteurs
σ

alterna*fs


Magnusson
et
al.,
2005


Régulation du taux de croissance par le ppGpp

Activité des promoteurs rRNA en
fonction de la concentration en ppGpp

Rôle des iNTPs ou du ppGpp pour la
régulation des promoteurs rRNA

Hernandez et al., 1990
Paul et al., 2004

ppGpp inhibe la réplication

ppGpp


Bacillus

ppGpp


E.
coli


dnaA


DnaA


Caulobacter


Primase


Chiaramello
et
Zyskind,
1990;
Wang
et
al.,
2007;
Lesley
et
Shapiro,
2008


ppGpp participe à l’induction de la réponse
générale au stress
Forte
densité
cellulaire

Forte
osmolarité

Faible
taux
de
croissance


rpoS


Basse
température


rpoS
ARNm


ppGpp


PH
faible

Carence
en
carbone

Haute
température


σS


protéolyse


EσS

Régulon
σs



Hengge‐Aronis,
2002


Action du (p)ppGpp dans la bactérie

Traxler
et
al.,
2008




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