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14/12/2011
Revêtement cutané n°13
Groupe n°1 – Estelle & Anissa

13

ANATOMIE
PATHOLOGIQUE
PARTIE II
I. INTRODUCTION
II. HISTORIQUE MICROSCOPIE MULTIPHOTONIQUE
III. FLUORESCENCE
IV. MICROSCOPIE CONFOCALE
V. MICROSCOPIE BIPHOTONIQUE
1. COMPARAISON FLUORESCENCE MICROSCOPIE CONFOCALE ET BIPHOTONIQUE
2. DÉVELOPPEMENT MÉTHODOLOGIQUES ET DOMAINES D'APPLICATION
3.

RAPPEL

: MICROSCOPE CONFOCAL (1-PHOTON)

4. MICROSCOPIE 3D DANS UN TISSU BIOLOGIQUE ?
5. ORGANISATION D'UN MICROSCOPE MULTI-PHOTONIQUE
6. RÉSOLUTION TRIDIMENSIONNELLE DU MICROSCOPE 2PEF
7. FENÊTRE OPTIQUE DANS L'IR
8. MOLÉCULES FLUORESCENTES ENDOGÈNES DANS LA PEAU
9. APPLICATIONS MICROSCOPIE MULTI-PHOTONIQUE

Chu de Caen

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I. INTRODUCTION
Premier microscope confocal en 1995


Marvin MINSKY



Sans laser, sans mémoire électroniques, ni beaucoup d’électronique ni dispositifs
piézoélectriques performants

Microscopie multiphoton 1989


WEBB W.W à la Cornell university



DENK Wilfrid Max Planck institue



STRICKLER

Cette microscopie met à profit la fluorescence naturelle, l'autofluorescence.
On utilise des rayonnements peu destructeurs, possibilité de biopsies optiques par
endoscopie et laparoscopie.

Mme Goeppert-Mayer. Américaine.Théoricienne physicienne
Elle a envisagé l'existence de l'absorption biphotonique dès 1929.
Prix Nobel de physique en 1963

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II. MICROSCOPIE MULTIPHOTON : Historique
Thèse STRUPLER
La microscopie multiphoton utilise les interactions non linéaires entre la lumière et la matière
(« Vous pouvez retenir ça… ») comme source de contraste.
Le processus non-linéaire à l’origine du développement de la microscopie multiphoton est
l’absorption à 2 photons et la fluorecence qui en découle.
(2PEF) démontré théoriquement par Maria Goeppert-Mayer en 1929 dans sa thèse.
Il a fallu ensuite 30 années et le développement des lasers pour le mettre en évidence
expérimentalement puis attendre 1990 pour que Winfried Denk, Jim Strickler et Watt W.Webb
l'appliquent à la microscopie. Par la suite, la microscopie multiphotonique s'est enrichie en utilisant
de nouveaux modes de contraste. Tout d'abord, la génération de second harmonique (SHG) mise
en évidence par P.A Franken et appliquée à la microscopie par Samuel Roth et Isaac Freud. Ce
n'est qu'une dizaine d'années plus tard que le groupe de Yaron Silberberg a mis en œuvre la
génération de troisième harmonique (THG).

III.

FLUORESCENCE

FORMULE GENERALE
Propriété de quelques atomes et molécules d’absorber une lumière (des photons) de longueur
d’onde donnée pour peu après émettre une lumière (des photons) de moindre énergie (λ >)

1. Absorption monophotonique


Un photon pousse un électron vers une orbitale supérieure



Quand il revient au repos : Emission d'un photon qui ne récupère pas toute l'énergie du
photon incident (donc de plus faible et énergie et de plus grande longueur d'onde).

2. Absorption biphotonique
« Comme au volleyball un joueur ne passe pas la balle directement de l'autre côté tout seul, 2
joueurs donnent des impulions coordonnées à une balle pour qu'elle passe le filet ».


Ici c'est le même phénomène, il y a besoin de 2 photons rouges pour pousser l'électron sur
une orbitale



Cet électron va émettre en émission de fluorecence, par exemple un photon vert.

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Il y a donc besoin de la coopération de 2 photons qui agissent,dans un espace temporel et
tridimensionnel extrêmement réduit.
Provoquer une absorption biphotonique suppose donc de mettre en jeu des intensités
lumineuses considérables pour que l'évènement est lieu.

Schéma Absorption et émission
Il existe aussi une courbe pour l'absorption biphotonique.
Ce n'est pas parce qu'il y a 2 photons qui doivent agir de
concert qu'il n'y a pas la plage des énergies nécessaires
pour que ces photons soientefficaces.
Ici : Coopération de 2 photons rouges ou infrarouges.

Rappel de la construction de ces
microscopes modernes = Microscope
biphotonique (Microscope à fluorecence et
épillumination)

Trajet des rayons lumineux incidents par l'objectif
(comme système par réflexion).
Excitation → La lumière passe au travers de l'objectif
→ Vient sur la substance fluorescente → La lumière
fluoresente ici en vert restraverse un miroir dichroïque.
Filtre d'excitation : Traversé par la lumière blanche de 450 <λ < 490 nm
Miroir dichroïque : Réfléchit les λ < 510 nm et transmet les λ > 510 nm
2ème filtre d'arrêt : Ne laisse passer que les λ de 520 à 560 nm

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IV.

MICROSCOPIE CONFOCALE

La source et le détecteur sont focalisés simultanément sur le même point par un jeu adapté de
trous d’épingles.
→ Le point focal d'illumination est le même que le point focal de détection.
1. EXCITATION


Un laser continu envoie un jet continu de lumière en 1 point (très bien focalisé)



Mais si on agrandit le point éclairé et excité on s'aperçoit que au foyer, dans le plan z
adéquat, on voit que l'intensité de l'excitation est considérable et que en avant et en arrière
de ce foyer, dans la direction de ce point, une lumière d'excitation apparaît.

Ici : Absoption monophotonique : Un photon bleu pousse un photon sur une orbitale S1 et au
retour de l'électron à sont orbitale de repos S0 il y a émission d'un photon de moindre énergie et
de plus grande longueur d'onde.

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2. EMISSION


La lumière de fluorescence qui jaillit du foyer où l'intensité était considérable, est une
intensité qui se fait dans toutes les directions



Une partie de ce rayonnement se dirige au travers de l'objectif (ayant une focale donnée)



Il se focalise dans ce point, appartenant à ce plan focal , plan focal conjugué au plan où se
trouve l'objet



La lumière focalisée dans le point de ce plan là va passer par le trou d'aiguille (En rouge :
diaphragme à trou d'aiguille)



Sur le détecteur en bas : Lumière en provenance principalement de ce point là dans ce
plan là

Microscope confocal à balayage laser (CLSM)

Le point focal d'illumination est le même que le point focal d'émission
Ce schéma représente à peu près les mêmes éléments.
Souvent utilisé avec épi-illumination en fluorecence (épi-fluorescence)


Excitation : bleu



Emission : vert

Si on excite fort au foyer, on a une émission forte en provenance du foyer qui va traverser en
direction du détecteur.
Les émissions parasites résultant d'une excitation parasite (en dessus ou dessous) vont exsister à
des intensités plus faibles et vont aller s'écraser sur le pin hole.

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Dans ces conditions, on réalise une section, une tomographie cellulaire.
Exemple

Classique

Confocale à balayage laser

On utilisait ce matériel des années 1990/2000.

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V.MICROSCOPIE BIPHOTONIQUE
1. Comparaison fluorescence excitée à 2 photons (2 PEF) & microscopie

confocale

Cuve remplie de fluroscéine
A gauche
Orifice par lequel le laser d’argon jaillit. Cette lumière, quand elle arrive dans la cuve suscite une
fluorescence.
→ Trainée de fluorescence sur toute l’épaisseur avec une tâche au centre fortement fluorescente
A droite
La source de droite envoie des pulses, des impulsions extrêmement courtes de lumière dont
l'intensité n'arrive à générer un événement biphotonique que dans le point central.
Point central : Point lumineux d’où émerge la lumière de fluorecence résultant d'une absorption
biphotonique.
On considère qu'il n'y a pas besoin de système comme le pin hole et de système comme dans les
microscopes confocaux.
On considère qu'il y a un confinement au plan focal et dans le point focal de l'excitation (et de
l'émission bien sûr ...!).
Laser titane safir : Coopération de 2 photons rouges pour arriver à déplacer l'électron, lequel,
quand il va revenir au repos, va émettre un photon vert.

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Pourquoi fait-on ça ? (Bonne question -_-)

Si on compare les 2


Gauche : Monophotonique



Droite : Biphotonique



Avec la lumière du soleil, un événement monophotonique intervient toutes les secondes
(schéma en bas à droite).



Probabilité biphotonique : Toutes les 10 millions d'années



Probabilité triphotonique (Tant qu'on y est!) : Il faudrait attendre l'âge de l'univers pour qu'un
seul événement triphotonique puisse se produire.

→ Avec le laser gaz Argon : Jet continu, flux continu de lumière
→ Avec le laser solide Titane safir : Pulses
Il faudrait des usines d'énergie considérable pour alimenter en continu de tels lasers.

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On peut soutenir une émission aussi intense si et seulement si elle est ponctuelle,
hachée dans le temps par petits pulse.
→ Cela consomme moins
→ Abime moins les tissus
Avantage de l'utilisation de l'infrarouge : Moins dangereux, inoffensif

2. Développement méthodologiques et domaines d'application

Courbe : Exponentielle (1990 → 2004) de l'augmentation du nombre d’application en microscopie
photonique
Développement méthodologiques importants


Nouveaux contrastes



Miniaturisation, endoscopie



Systèmes fibrés



acquisition rapide (multipoint, scan rapide)



Pulse shaping, optique adaptative

Quelques domaines d'application


Neurosciences



Biologie du développement



Physiologie

– Dermatologie
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3. Rappel : Microscope confocal (1-photon)
Résolution en rapport


En latéral, en xy, avec λ/NA



En z, en profondeur avec λ/NA²



En microscopie confocale classique on utilise plutôt des rayonnements visibles et
énergétiques donc de forte énergie et de courte longueur d'onde : Bonne résolution.



En infrarouge, de longueur d'onde plus grande, on pert de la résolution.

La microscopie multi-photonique ne va donc pas nous donner de grandes
performances en termes de résolution.
Par ailleurs, elle a des qualités d'aptitude, de par l'utilisation des infrarouges, à être
assez pénétrante.

4. Microscopie 3D dans un tissu biologique ?
Haute résolution → Repose sur la lumière non diffusée. Mais la lumière visible est fortement
diffusée dans les tissus.
Emission de la lumière dans un tissu biologique Des photons balistiques traversent, d’autres
diffusent. Passée une certaine épaisseur, on a plus assez de lumière pour faire une image

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a) Microscopie (confocale) en milieu diffusant
On a un fort signal mais c'est un bruit de fond : Très brouillé.


Diffusion de la fluorescence → Bruit de fond



Diffusion de la lumière excitatrice → Signal atténué

Pénétration limitée par la diffusion.

b) Microscopie 2PEF en milieu diffusant : Infrarouge


Meilleure pénétration



L'infrarouge diffusé ne produit pas de fluorecence
→ Bruit de fond réduit

c) Conclusion
La lumière bleue qui se diffuse dans un tissu qu'on excite, va aller exciter des molécules à côté
(Microscopie confocale). Alors que la lumière infrarouge n'est, elle, pas en quantité suffisante pour
exciter.


Notion de seuil

Toute la lumière infrarouge qui diffuse est sans conséquence.
Seul l'infrarouge qui pénètre et se focalise dans la zone focale est susceptible d'avoir des
conséquences et générer un signal de fluorecence.

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Mise en évidence de la différence entre un flux continu et un flux de pulse
→ Dépense d'énergie moindre
→ Pas d'effet chauffant permanent sur les tissus

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5. Organisation d'un microscope multi-photonique



Source avec un laser pulsé



Scanner pour diriger le faisceau point par point (microscope à balayage)



On envoie la lumière au travers d'un miroir dichroïque, au travers d'un objectif



Arrive sur une préparation



La fluorecence qui en émane part dans toutes les directions



Elle est collectée



Elle est renvoyée vers des détecteurs

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6. Résolution tridimensionnelle du microscope 2PEF


En latéral : λ/2NA → Pas extraordinaire



En axial, en z : 1,3 nλ/NA² → Pas extraordinaire

Car λ est assez grand comme on prend de l'infrarouge (Plus du double du violet).
On peut dire que c'est une résolution comparable à celle du microscope confocal.
Typiquement 2µm * 0,4µm (ouverture numérique NA = 0,9)
Quand on travaille en mode fluorecence biphotonique on est un peu mieux qu'en mode réflexion


Un peu mieux que RCLSM : 0,5 et 1,2µm en latéral et axial

7. Fenêtre optique dans l'IR
IMPORTANT ♥
Il y a une fenêtre optique dans l’infrarouge


Mis en évidence par Anderson et Parish en 1981



« On le devine. Quand on éclaire notre main avec une lumière blanche, de l'autre côté on
voit ressortir du rouge, si on avait des yeux qui voyait l'infrarouge, on verrait encore mieux
l'infrarouge qui ressort. »



L'infrarouge traverse nos tissus



La peau humaine est trouble, diffusante et absorbante pour la lumière visible : finesse du
specimen requise

Cette fenêtre optique de l'infrarouge a permis 2 modalités :


Reflectance mode cofocal laser scanning microscopy RCLSM



Multiphoton laser scaning microscopy MPLSM

Profondeur de pénétration : 200µm (« C’est ce qui nous intéresse ce soir… »)

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8. Molécules fluorescentes endogènes dans la peau


NAD nicotanamide adénine dinucléotide réduit



NADPH



Collagène



Kératine



Elastine



Flavine



Lipofuscine

Gros avantage de microscopie multi-photonique à fluorecence : Elle excite des molécules qui sont
déjà présentes dans notre corps cad qu'on a pas besoin d'apporter de produits (souvent toxiques).
On a simplement à illuminer des molécules qui sont présentes dans notre peau.
Ces molécules sont généralement excitables avec un photon énergétique, elles le sont aussi avec
2 photons IR moins destructeurs pour la peau.

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9. APPLICATIONS microscopie multi-photonique


Cellule mitrale



Imagerie calcique



Dermatologie

a) Application à la dermatologie

Ces images résultent de l'imagerie avec absorption biphotonique de fluorescence sur des
prélèvements nouveaux à côté de lésions plus ou moins cancéreuses.


Exérèse



Mise à plat des morceaux



On met le microscope de telle sorte à ce qu'on puisse acquérir l'image sur la surface, puis
un peu sous la surface, et de plus en plus en profondeur



Plage de réglage à 2ooµm



Obtention de ces images à différentes profondeurs, sans même à avoir à couper la
peau !

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Par la suite, des Allemands ont proposé une machine, un microscope, que l'on met dans la salle
de dermatologie.
→ « Le patient met son bras, son nez, enfin met ce qu'il veut … sous le microscope ».

Microscopie multi-photonique : En face MPLSM (Multi photon laser scanning microscope)
“En face” : On a une pile de sections possibles à acquérir dans le plan même de la peau quand
elle est présentée face à nous : Tranches virtuelles.


Marche avec un microscope 40 * Na (grossit 40 fois) = 0.8 Immersion à l'eau (Donc pas
toxique)
→ « Il suffit de mettre de l'eau sur la peau du 'client' pardon 'patient' et de poser l'objectif
dessus » ^^



Profondeur de 135 µm : Accès à l'épiderme et derme supérieur



Emission à 450 530 : Fluorescence du NADPH, nicotonamide dinucléotide (NAD) kératine
élastine collagène et mélanine

Photos (page 17)


Ligne supérieure (A): Normal périlésionnel



Ligne intermédiaire (B): Cellules squameuses d'un carcinome in situ



En bas (C): Carcinome à cellules superficielles

On observe donc la peau à différentes profondeurs.
Travail des nouveaux dermatologues : Bien interpréter ces images, cela va être un nouveau
métier.
Jusqu'à présent pour avoir ce type d'images on faisait unebiopsie qu'on envoyait chez les
anapath'. Alors que là tout se fait dans le cabinet du dermatologie, on peut avoir les résultats plus
rapidement.
Pour les curieux et motivés : www.jenlab.de/fileadmin/user/DermaInspect.pdf
Machines très couteuses

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b) Autres applications en dermato


Vieillissement de la peau



Contrôle de la cicatrisation



Contrôle du pH cutané



Contrôle de la pénétration ou de la délivrance de médicaments

Au delà de la possibilité de mettre en avant des fluorescences endogène, on peut aussi faire des
études complémentaires avec :
– Ac marqués
– Polarisation
– Secondes harmoniques : Le collagène est générateur de secondes harmoniques
Image : Neurone avec émission de secondes harmoniques

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