GFMOM TD 1 levure .pdf



Nom original: GFMOM TD 1 levure.pdfTitre: TD1 LevureAuteur: Anaïs LE KHAL

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TD    GFMOM  Levure  1  

 

14/03/12  

Levure comme organisme modèle :
Cycle cellulaire ; cytokinèse ; recombinaison ; réplication ; réparation ; architecture
nucléaire ; chromatine ; transcription ; métabolisme énergétique ; trafic ; traduction ; génome ;
stabilité ; évolution ; ect
Les  prions  de  levures  qui  sont  très  nombreux  (20),  utilisation  de  composer  pour  lutter  
contre   eux  :   protéine   infectieuse,   agent   responsable   de   la   vache   folle=   tremblante   du  
mouton.  Protéine  de  l’organisme  PRP,  prend  différent  état  :  normal  ou  prion.  Quand  il  y  
a  rencontre  entre  une  protéine  normale  et  une  protéine  prion,  la  protéine  prion  oblige  la  
protéine   normale   à   changer   de   conformation,   accumulation   protéine   prion,   c’est   à  
l’origine  de  la  maladie.  Il  n’y  a  pas  d’acide  nucléique,  c’est  uniquement  les  interactions  
entre   les   protéines.   La   levure   est   utilisé   en   organisme   modèle,   délétion   rapide,   sélection  
de  mutant  et  trouver  de  nouveau  partenaire  dans  un  organisme.  
 
Génétique   direct  /   classique   :   on   s’intéresse   à   la   réparation   ou   à   la   stabilité   des  
génomes,   recherche   de   mutant   par   mutagénèse,   identifier   de   nouveaux   gènes   pour  
complexifier  le  schéma.  On  part  d’une  voie,  d’un  phénomène  qui  nous  intéresse  et  l’on  
recherche   de   nouveaux   mutants   pour   identifier   de   nouveaux   acteurs.   Sélection   par  
crible.  
 
Génétique  inverse  :  gène  qui  nous  intéresse  et  l’on  veut  savoir  dans  quoi  intervient  la  
protéine  codée  par  ce  gène.  Dans  quel  mécanisme  la  protéine  est  impliquée,  cela  passe  
par   la   délétion   du   gène,   et   ensuite   tester   une   batterie   de   phénotype   pour   voir   ou   va  
intervenir  cette  protéine.  
 
Haplodiplobiontique  :   la   levure   est   capable   de   se   multiplier   à   l’état   haploïde,  
conjugaison  -­‐>  obtention  diploïde.  Multiplication,  obtenir  des  clones  à  l’état  diploïde  et  
par  la  suite  il  y  a  la  méiose,  la  sporulation  qui  permet  de  revenir  à  l’état  haploïde.    
 
 
PARTIE  I  
 
Déterminez   combien   de   sites   sont   mis   en   jeu   dans   chacun   des   caractères  
considérés.  En  les  prenant  deux  à  deux,  établissez  la  carte  génétique  de  ces  sites.  
 
a  et  α  sont  les  types  sexuels.  On  ne  peux  jamais  avoir  de  diploïde  homozygote  (a/a  ou  
α/α)    
 
Il  faut  déjà  monter  chacun  des  caractères,  qui  sont  contrôlés  par  un  seul  site.  
On  prend  les  caractères  un  par  un.  
 
Hypothèse  1  :  Dans  ce  croisement,  la  prototrophie  pour  le  tryptophane  est  contrôlé  par  
un  site  ou  un  gène  appelé  TRP1  avec  deux  allèles  trp1-­‐1  et  TRP1.  
 
On   ne   précise   pas   si   le   site   ou   le   gène   était   situé   sur   un   autosome   ou   un   chromosome   X   car  
cela   n’existe   pas   dans   la   levure.   Pas   de   chromosome   sexuel   dans   la   levure   mais   un   locus  
sexuel   qui   est   sur   un   chromosome   mais   l’autre   partenaire   a   le   même,   il   y   a   juste   une  
différence   au   niveau   du   locus   sexuel,   il   n’y   a   pas   de   chromosome   sexuel   comme   on   l’entend  
chez  les  animaux.  

TD    GFMOM  Levure  1  

 

14/03/12  

 
B  

trp  1-­‐1      
 
 
 

[TRP-­‐]            X  

C  

TRP1    

[TRP+]  

2n  
trp  1-­‐1                      [  TRP+]  
                                                                                                                                                       TRP1  
 
TRP1  >  Trp  1-­‐1  
Le   phénotype   associé   à   l’allèle   TRP1   est   dominant   sur   le   phénotype   associé   à   l’allèle  
trp1-­‐1.  
 
 

Sporulation  
50%  trp1-­‐1      [TRP-­‐]  
50%  TRP1          [TRP  +]  
 

Analyse  sur  1000  spores  
 
[TRP  +  ]  
[TRP  -­‐  ]  

Effectif  théorique  
Effectif  observé  
500  
501  
500  
499  
 
On   constate   que   les   effectifs   ne   sont   pas   significativement   différents,   hypothèse   de   un  
site  est  donc  accepté.  
 
Hypothèse  2  :  Dans  ce  croisement,  la  prototrophie  pour  la  méthionine  est  contrôlé  par  
un  site  ou  un  gène  appelé  MET3  avec  deux  allèles  met3-­‐1  et  MET3.  
 
 
 
B  
MET3      
[MET+]      
         X   C  
met  3-­‐1  
 
[MET-­‐]  
 
 
 
2n  
met  3-­‐1                      [MET+]  
                                                                                                                                                   MET3  
 
MET3  >  met  3-­‐1  
Le  phénotype  associé  à  l’allèle  MET3  est  dominant  sur  le  phénotype  associé  à  l’allèle  met  
3-­‐1.  
Sporulation  

 
 

50%  met  3-­‐1      [MET-­‐]  
50%  MET3          [MET+]  
 
 
 

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1000  spores  
[MET  +]  
[MET  -­‐]  

Effectif  théorique  
Effectif  observé  
500  
497  
500  
503  
 
 
On   constate   que   les   effectifs   ne   sont   pas   significativement   différents,   hypothèse   de   un  
site  est  donc  accepté.  
 
Hypothèse  3  :  Idem  pour  la  thermo  sensibilité,  on  conclut  à  un  seul  site.  
 
Etude  de  liaison  :  indépendant  ou  liés  
 
Il  y  a  3  façons  de  faire  :  
 
1/  Test  de  l’indépendance  
 
trp  1-­‐1  
MET3                        X    
 
 
 
 
 
 
 
trp  1-­‐1  
 
 
 
 
 
TRP1    
 
 
 

 

 

TRP1    

met  3-­‐1  

MET  3  
met  3-­‐1  

PARENTAUX  

Trp  1-­‐1  
TRP  1    

MET3    
met  3-­‐1  

[TRP  -­‐    MET  +]  
[TRP  +  MET  -­‐]  

RECOMBINES  

Trp  1-­‐1  
TRP1    

met  3-­‐1  
MET3    

[TRP  –  MET  -­‐]  
[TRP+  MET+]  

 

 
Si  il  y  a  indépendance  alors  on  s’attend  à  25%  de  chacune  des  catégories.  
1000  spores  
TRP-­‐            MET+  
TRP+          MET-­‐  
TRP-­‐            MET-­‐  
TRP+          MET+  

Effectif  théorique  
250  
250  
250  
250  

Effectif  observé  
401  
405  
98  
96  

 
Les   résultats   observés   et   théoriques   sont   significativement   différents   donc   les   sites   sont  
liés.  On  peut  calculer  une  distance.  
 
Distance  =            Nombre  de  recombinés  x  100    =     (98+96)  x  100    =    19,4  cM  
     
 
           Nombre  total  
 
 
             1000  
 
 
 

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2/  Calcul  de  fréquence  
 
Frec  =    Nombre  de  recombinant      =    96+98    =      0,194  
     
                   Nombre  total    
     1000    
 
La  fréquence  est  comprise  entre  0  et  1.  
Si  fréquence  de  recombinaison  est  d’environ  0,50  alors  il  y  a  indépendance.  
Si   fréquence   de   recombinaison   est   inférieur   à   0,5,   les   gènes   sont   liés,   on   calcul   la  
distance.  
On  multiplie  par  100  pour  obtenir  des  cM.  
Ici  les  sites  sont  liés  0,194  <  0,5.  
 
3/  Ici  on  a  Parentaux  >  Recombinés    (401+405  >  96+98)  
Les  2  sites  sont  liés,  on  peut  calculer  la  distance.  
 

 
Distance  TRP1  –  TS1  =  [(75+65+102)  x  100]  /  1000  =  14  cM  
Distance  MET3  -­‐  TS1  =  [(1+2+31+26)  x  100]  /  1000  =  6  cM  
 
 
Carte  génétique  
 

 

 
 
19,4  est  différent  de  6+14,  on  a  négligé  les  doubles  recombinants.  Deuxième  et  troisième  
ligne  du  tableau.  
 
Taille  du  génome  de  Saccharomyces  cerevisiae  =  12/13  Mb,  6  600  gènes.  
1  cM  =  2  kb  dans  la  levure.    
 
 
 
 
 

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PARTIE  II  
 
A  l’aide  d’un  schéma,  décrivez  le  ou  les  événement(s)  pouvant  être  à  l’origine  de  
cette  souche  transformée.  
 
On  part  du  gène  et  on  essaye  de  déterminer  le  rôle  de  la  protéine  codée  par  le  gène.  
 
met3+  =  MET3+  
 
Transformation,  on  veut  obtenir  la  délétion  de  t.  Délétion  de  la  partie  codante.  
Pour  faire  une  recombinaison  dans  la  levure,  il  faut  30  pb  pour  que  la  levure  soit  capable  
de   faire   de   la   recombinaison.   Puis   on   réalise   une   PCR,   le   produit   contient   le   marqueur  
LEU2  complet  plus  de  chaque  côté  les  régions.  (bleu  et  vert  sur  le  schéma).  Il  y  a  donc  
possibilité   de   recombinaison.   On   obtient   une   souche   délétée   pour   t.   On   a   laissé   LEU2  
sous  son  propre  promoteur  et  non  sous  le  promoteur  de  t  car  on  ne  sait  pas  quand  il  est  
exprimé.   Or   on   veut   que   de   l’enzyme   LEU2   soit   toujours   produite   pour   obtenir   une  
souche   prototrophe   pour   la   leucine.   Avec   toujours   les   régions   homologues.   Obtention  
d’un  hétérozygote  LEU2  et  leu2-­‐1,  on  obtient  une  souche  [LEU+].  
 

 
Autres  types  de  transformant  :  [LEU+]  
 
-­‐ recombinaison  homologue  au  locus  LEU2  
 

 

 
 
Efficacité   de   la   recombinaison   dépend   de   la   taille   des   régions   homologues,   ici   régions  
beaucoup  plus  importante  donc  on  s’attend  à  avoir  une  efficacité  plus  importante.  
 
-­‐ recombinaison  non  homologue  
Recombinaison  n’importe  ou  dans  le  génome.    
 
 
PCR  sur  le  fragment  contenant  t  est  une  bonne  méthode  mais  on  n’utilise  pas  de  grand  
fragment.  Le  Southern  Blot  est  là  pour  vérifier  l’amplification  par  sonde.    
 
Pourquoi   des   diploïdes  ?   Car   l’on   peut   déleter   un   gène   essentiel   à   la   survie  
contrairement   aux   haploïdes   ou   l’on   obtiendrais   que   des   recombinaisons   non  
homologues.  Attention  à  la  délétion  des  gènes.  
 

TD    GFMOM  Levure  1  

 

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PARTIE  III  
 

Quelles  conclusion  tirez-­vous  de  cette  observation  ?  
 
On   récupère   le   diploïde,   on   récupère   le   transformant,   il   y   a   sporulation,   analyse   de  
tétrades,  analyse  en  asques.  
Quand  on  sème  4  spores,  il  y  en  a  2  qui  se  développent  et  2  qui  ne  se  développent  
pas.  On  a  une  ségrégation  2  :2.  
 
Possibilités  :  
T  est  essentiel  à  la  survie  de  la  levure.  
T  est  essentiel  à  la  germination  des  spores.  
 
Expérience  pour  faire  la  différence  entre  un  gène  essentiel  et  un  gène  essentiel  pour  la  
germination.  
Mettre  t  sur  un  plasmide  qui  est  sous  le  contrôle  d’un  promoteur  inductible  par  le  froid  
ou  par  le  chaud.  Avoir  un  promoteur  régulé.  Au  niveau  de  la  spore  on  exprime  t,  on  
regarde  la  germination.  Si  germination  on  se  met  dans  des  conditions  ou  t  n’est  plus  
exprimé  et  l’on  regarde  s’il  y  a  survie  ou  non.  Mettre  t  dans  un  plasmide  où  l’on  peut  
induire  son  expression  par  des  conditions  environnementales.  Est  ce  que  l’on  est  
capable  de  récupérer  les  spores  ?  Transformation  du  diploïde.  Si  oui,  t  est  indispensable  
pour  la  germination  quand  on  passe  dans  des  conditions  environnementales  ou  t  n’est  
plus  exprimé,  ou  même  en  exprimant  t  dans  les  spores  qui  germe.  T  est  probablement  
un  gène  essentiel.  
 
PARTIE  IV  
 
1/  Est-­ce  étonnant  
Non  étonnant  car  on  a  remplacé  t  .  Au  niveau  du  diploïde  à  avoir  une  situation  
d’hétérozygotie  pour  le  locus  t,  donc  on  obtient  :  
 
 
Δt  ::LEU2/t  
 
2  spores  Δt  ::  LEU2   [LEU+]  
2  spores  t    [LEU-­‐]  
 
2/  Ecrivez  le  génotype  des  4  spores  de  ces  différentes  tétrades.  Comment  
interprétez  vous  les  fréquences  de  ces  trois  types  de  tétrades  ?  
 
 

Analyse  en  asque.  

 

TD    GFMOM  Levure  1  

 

14/03/12  

Le  nombre  de  DP  ≠  DR  donc  les  sites  sont  liés.  On  a  aussi  DP  >  DR  
 
 

 
 
Pour  calculer  la  distance  :  
 
Distance  =  2TT  +  4DNP  /  4  x  nombre  de  tétrades  =  58*100  /  400  =  14,5  cM.  
 
Avec  les  tétrades,  on  peut  tenir  compte  des  doubles  crossing  over  rien  qu’avec  2  
caractères.  
 

 
On  considère  une  fois  1  CO  et  deux  fois  ceux  qui  on  2  CO.  
Quand  on  a  1  CO,  on  a  un  TT.  
O  CO  =  DP    
1  CO  =  TT  
 
2  CO  =  DNP    
Quand  on  prend  en  compte  les  2  CO  pour  le  calcul  de  la  distance  :  
On  inclut  2  fois  ceux  qui  ont  un  événement  de  double  crossing-­‐over.  
Distance  =  4x4xnombre  de  DNP  +  2(TT-­‐2DNP)  /  4  x  nombre  total  d’asque  
Distance  =  [(1/2)TT  +  3DNP  /  nombre  d’asque]  x  100  =  16,5  cM  
Distance  plus  précise  pour  ces  2  sites.  
 
 

 

TD    GFMOM  Levure  1  

 

14/03/12  

3/  
Ecrivez  le  génotype  des  4  spores  de  ces  différentes  tétrades.  Comment  interprétez  
vous  les  fréquences  de  ces  deux  types  de  tétrades  ?  (  A  faire  à  la  maison)  
Raisonnement  idem  qu’au  dessus  pour  MET    
Distance  MET3-­‐t  =  6  cM  
 
Quelle   précision   vous   apporte   l’ensemble   de   ces   résultats   sur   l’événement   ayant  
donné  naissance  à  la  souche  transformée  E  à  partir  de  la  souche  D  ?  
Les   distances   sont   proches,   on   ne   peut   exclure   l’hypothèse   que   les   mutants   sélectionnés  
en  première  partie  et  t  correspondent  à  la  même  chose.  
Ces  résultats  vous  suggèrent-­ils  une  relation  entre  l’unité  de  transcription  «  t  »  et  
le   gène   dont   la   mutation   empêche   la   multiplication   de   la   souche   B   à   32°C  ?  
Proposez  une  expérience  permettant  de  tester  cette  hypothèse.  
1  gène  =  2  cM  donc  pour  t  et  le  premier  caractère,  on  a  la  même  distance  donc  il  serait  au  
même   endroit   donc   sur   le   même   gène.   Le   premier   mutant   soit   muté   dans   t   ,   l’hypothèse  
la  plus  simple  pour  tester  cette  idée  est  l’utilisation  de  la  technique  de  complémentation  
fonctionnel,  permet  de  dire  si  ils  sont  touchés  sur  le  même  gène  ou  non.    
Si  retour  au  phénotype  sauvage,  ils  ne  sont  pas  mutés  dans  le  même  gène.  
Si  maintient  du  phénotype  mutant,  ils  sont  mutés  dans  le  même  gène.  
On  peut  alors  déterminer  si  TS1  est  muté  dans  t.  
 
 
 
 
   
 


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