Manuscrit de thèse Arnaud Chevalier .pdf



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THESE DE DOCTORAT
Pour l’obtention du grade de

DOCTEUR EN SCIENCES DE l’UNIVERSITE DE
ROUEN
Spécialité : Chimie Organique
Soutenue le 17 Octobre 2014
Par

Arnaud CHEVALIER
Développement de nouveaux outils chimiques pour la
synthèse de sondes optiques fluorogéniques pour la
détection d’activités enzymatiques en milieu biologique.
Volume I: Etat de l'art, résultats et discussiio
ons

Devant le jury composé de :
Dr. Alain Wagner – Président de Jury

Directrice de Recherche CNRS, Strasbourg

Dr. Agnès Delmas – Rapporteur

Directrice de Recherche CNRS, Orléans

Pr. Ludovic Jullien – Rapporteur

Professeur, Université Pierre et Marie Curie Paris

Pr Norbert Lange – Examinateur

Professeur, Université de Genève

Dr. Sylvain Orenga – Membre
embre invité

Entreprise bioMérieu, Lyon

Pr. Pierre-Yves Renard – Examinateur

Professeur, Université de Rouen

Dr. Anthony Romieu– Examinateur

Professeur, Université de Bourgogne

Dr. Christine Beaudequin – Examinateur

Maître de conférences,, Université de Rouen

THESE DE DOCTORAT
Pour l’obtention du grade de

DOCTEUR EN SCIENCES DE l’UNIVERSITE DE
ROUEN
Spécialité : Chimie Organique
Soutenue le 17 Octobre 2014
Par

Arnaud CHEVALIER
Développement de nouveaux outils chimiques pour la
synthèse de sondes optiques fluorogéniques pour la
détection d’activités enzymatiques en milieu biologique.
Volume I: Etat de l'art, résultats et discussiio
ons

Devant le jury composé de :
Dr. Alain Wagner – Président de Jury

Directrice de Recherche CNRS, Strasbourg

Dr. Agnès Delmas – Rapporteur

Directrice
ce de Recherche CNRS, Orléans

Pr. Ludovic Jullien – Rapporteur

Professeur, Université Pierre et Marie Curie Paris

Pr Norbert Lange – Examinateur

Professeur, Université de Genève

Dr. Sylvain Orenga – Membre
embre invité

Entreprise bioMérieu, Lyon

Pr. Pierre-Yves Renard – Examinateur

Professeur, Université de Rouen

Dr. Anthony Romieu – Examinateur

Professeur, Université de Bourgogne

Dr. Christine Beaudequin – Examinateur

Maître de conférences,, Université de Rouen

Remerciements
Mes premiers remerciements vont au professeur Pierre-Yves Renard qui m'a accueilli dans son
laboratoire durant ces 3 années et qui m'a toujours accordé sa confiance. Il m'a laissé carte
blanche dès le début sans jamais douter de moi, sa disponibilité, ses conseils et sa bonne humeur
permanente sont autant de raisons pour lesquelles venir travailler n'a jamais été une corvée.
Bien entendu cette thèse n'aurait jamais pu aboutir à ces résultats sans la participation au jour le
jour du désormais professeur Anthony Romieu. Tony c'est une culture incroyable de la chimie
des fluorophores et une connaissance des techniques d'analyse et de purification qui ont été
d'une aide plus que précieuse lors de cette thèse. Bien entendu, s'il y a une chose que j'ai apprise
auprès du "Chef" c'est une exigence et une rigueur dans le travail qui ne sera malheureusement
jamais aussi grande que la sienne …
Je tiens à adresser mes sincères remerciements à tous les membres du jury qui m’ont fait
l’honneur d’accepter de juger mon travail.
Pour leurs conseils et leur disponibilité, je n'oublie pas les autres permanents, Cyrille Sabot,
Ludovic Jean, Jacques Maddaluno, Michael De Paolis, Julien Legros, Christine Beaudequin, Xavier
Franck qui ont tous à un moment participé à la réussite de ma thèse.
Mes remerciements vont aussi aux divers chercheurs avec qui j'ai pu collaborer lors de cette
thèse, le professeur Norbert Lange, M. Sylvain Orenga et le professeur Professeur Kenjiro
Hanaoka.
Je n'oublie Le personnel de L'IRCCOF, Patricia, TiaTia, Emilie, Laurent. Une pensée particulière à
notre désormais verrier retraité Roland qui m'a fourni ces ballons rodage ½ de 500µL sans
lesquels j'aurai bien eu bien du mal réussir certaines réactions.
La liste des étudiants que j'ai pu croiser lors de cette thèse est très très…. très longue. Les
premières personnes que je souhaite remercier sont mes anciens collègues de l'équipe du chef
Tony Prot et Champion qui m'ont réellement beaucoup appris lors de mon arrivée dans le
laboratoire. Je n'oublie pas les autres anciens membres de l'institut, Phillipe le Portos, Boule,
P'tit Lu, Rudjjji, Le Roux, Catoche, Tristanus, Virgilus Granclaudus, Seb, La Shpill, Jacky, Thomas,
Guillaume et Guillaume qui sont parti pour certain depuis longtemps maintenant, mais que je
n'oublie pas.

Il reste malgré tout du monde dans cet institut… Forcément Yul Turner qui est là depuis le début
(et surtout qui a toujours été là…) L'homme du Sud pour sa dégustation d'andouillette du
dimanche midi arrosée de ricard bien frai. Monica, Sovy, Emilie et Marine qui ont contribué
(malgré moi) à une prise de poids alors que j'étais au "régime". Mes deux roumégeurs favoris, à
savoir Kiki et Poupousse "qu'on comprend rien à qu'est ce qui disent". Bien entendu Roubax le
Jambax et Burne pour leur bonne humeur lors de la sortie des déchets… la cellule 232 pour ces
cris inquiétants à toute heure. Medhi pour les mousses au chocolat et les tiramisus et tous les
autres Morgane, Nadia, Gabriella enfin tout le monde quoi.
Il y a une catégorie de doctorants un peu particuliers qui ont beaucoup compté dans ma thèse
puisqu'ils ont vécu la même aventure que moi depuis 2011. Des doctorants qui pour certains
sont déjà docteurs ou qui le seront bientôt, Laurie-Anne, Siouxxx, Chachou, Maxime (sans doute
un des moins bruyants de la 232) et tout particulièrement mes deux potes Alex et
RRRRrrrrromain dont le canapé m'a été particulièrement utile ces derniers mois….
Un merci qui ne sera jamais assez grand pour Virginie sans qui j'aurais surement lâché prise
depuis longtemps. Elle m'a réconforté quand ça n'allait pas, m'a écouté râler sans perdre
patience et bien d'autres choses qui fond que je ne l'oublierai jamais.
Pour finir, mon père, car c'est sans doute lui qui m'a transmis cette passion pour la science ainsi
que la volonté permanente de comprendre ce qui se passe autour de nous, ce qui m'a servis
chaque jour au labo. Enfin ma maman pour sa patience, son amour qui a réussi à me transmettre
son humilité et sa générosité. Tous deux m'ont toujours soutenu et je les en remercie.

Liste des abréviations
A

Analyte

Abs

Absorption/Absorbance

Ac

Acétyl

ADN

Acide Desoxyribonicléique

Aq.

Aqueux

Ar

Aryl

BHQ

Black Hole Quencher

Bn

Benzyl

Boc

t-butyl carbamate

BOP
hexafluorophosphate

(Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium

BSA

Bovine Serum Albumin

CH3CN

Acétonitrile

Cy

Cyanine

DAO

7-hydroxy-9H-(9,9-dimethylacridin-2-one)

DCC

Dicyclohexylcarbodiimide

DCM

Dichlorométhane

DDAO

7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one)

DEAC

7-N-diethylaminocoumarine

DIEA

Di-isopropylamine

DMF

Dimethylformamide

DMSO

Dimethylsulfoxide

Em

Emission

Et

Ethyl

EtOH

Ethanol

ESI

Electrospray ionization

Exc

Excitation

FRET

Foster Resonance Energy Transfer

HOMO

Highest Occupied Molecuolar Orbital

MOM

Metoxymetyl

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

ICT

Iternal Charge Transfer

IRM

Imagerie par Résonance Magnétique

LUMO

Lowest Unoccupied Molecular Orbital

Me

Methyl

MeOH

Methanol

NBS

N-Bromosuccinimide

NHS

N-hydroxysuccinimide

NIR

Near Infra-Red

nm

nanomètre

NMP

N-methylpyrrolidone

PABA

Para Amino Benzoïc Acid

PBS

Phosphate Buffer Saline

Pd

Palladium

PEG

Polyethylène glycol

PET

Positron Emission Tomography

PeT

Photoindiced Electron Transfer

Ph

Phenyl

pH

Potentiel Hydrogène

PMB

para-metoxybenzyl

Q

Quencheur

QD

Quantum Dot

QY

Quantum Yield

R

Rhodamine

RMN

Mésonance magnétique nucléaire

SEAr

Substitution électrophile aromatique

SNAr

Substitution nucléophile aromatique

SPECT

Single-Photon Emission computed tomography

SR

Sulforrhodamine

Std

Standard

TA

Température ambiante

TEA

Triethylamine

Tf

Triflate

TFA

Acide trifluoroacétique

THF

Tetrahydrofurane

Tol

Toluène

UV

Ultraviolet

WS

Water Soluble

Préambule
Ces travaux de thèse on été effectués entre le 1er Octobre 2011 et le 30 Août 2014 au sein de
l'équipe Chimie Bio-Organique (équipe 2 du laboratoire COBRA, UMR CNRS 6014,
http://www.lab-cobra.fr/?equipe=equipe-2) dirigée par le Professeur Pierre-Yves Renard, dans
le bâtiment nommé "Institut de Recherche en Chimie Organique Fine (IRCOF)" et localisé sur le
site de Mont-Saint-Aignan de l'Université de Rouen. L'ensemble de cette thèse a été co-encadrée
par le Professeur Pierre-Yves Renard et le Docteur Anthony Romieu (nommé Professeur à
l'Université de Bourgogne depuis le 1er Septembre 2013 et exerçant ses activités de recherche au
sein de l'Institut de Chimie Moléculaire de l'Université de Bourgogne (ICMUB, UMR CNRS 6302),
à Dijon, à compter de la même date).
Plusieurs collaborations avec des partenaires extérieurs ont permis de valider sur le plan
biologique une partie des molécules synthétisées et présentées dans ce manuscrit. Ainsi, les
expériences concernant la détection in cellulo de protéases ont été effectuées par l'équipe du
Professeur

Norbert

Lange

de

l'Université

de

Genève

(http://www.unige.ch/sciences/pharm/fagal/page-perso/lange.php?id=33). Les expériences
sur cultures bactériennes ont été effectuées au sein du département R&D Microbiologie de la
société bioMérieux localisé près de Grenoble et dans l'équipe de Monsieur Sylvain Orenga. Enfin,
la validation in cellulo des sondes pro-fluorescentes destinées à imager le phénomène d'hypoxie
a été effectuée à la Graduate School of Pharmaceutical Sciences de l'Université de Tokyo par
l'équipe du Professeur Kenjiro Hanaoka (http://www.f.u-tokyo.ac.jp/~taisha/en/researchen.html). Tous les travaux expérimentaux rapportés dans ce manuscrit sont issus de mon travail
personnel sauf mention explicite du contraire. J'ai en particulier collaboré avec deux autres
doctorants du laboratoire: Mademoiselle Laurie-Anne Jouanno (dont la soutenance de thèse est
prévue le 5 Novembre 2014) et Monsieur Benoît Roubinet (étudiant en seconde année de thèse
dont la soutenance est prévue en septembre-octobre 2015). Les caractérisations analytiques
(RMN, IR et spectrométrie de masse) des (bio)molécules synthétisées ont été effectuées par moimême mais aussi par des personnels du COBRA, du laboratoire PBS ("Polymères Biopolymères
Surfaces", UMR CNRS 6270, http://pbs.univ-rouen.fr/) et de PACSMUB ("Plateforme d'Analyse
Chimique

et

de

Synthèse

Moléculaire

de

http://wpcm.fr/index.php?page=presentation-generale).

l'Université
L'ensemble

de
des

Bourgogne",
résultats

expérimentaux sont reportés dans les cahiers de laboratoire D34382, C38102, C39570, C59989,
D54261, D54146 et D54148. Ces travaux ont été financés par des fonds FEDER ("Fonds
Européens de Développement Régional") dont la gestion administrative a été assurée par la
délégation régionale Normandie (délégation régionale n°19) du CNRS.

Mon mémoire de doctorat est rédigé sous forme de thèse sur publications pour une grande
partie des résultats obtenus. Par ailleurs, il se compose de deux volumes dont le second est
réservée aux seules parties expérimentales (principalement les fichiers "Supporting
Information" des publications présentées dans le premier volume).
Ce manuscrit rassemble l'ensemble des résultats obtenus lors de mes trois années de thèse dont
la majorité a été dédiée au travail expérimental de synthèse, d'analyse et de validation des outils
chimiques envisagés. L'objectif de ce manuscrit est aussi de replacer ces réalisations dans le
contexte de la (bio)chimie pour l'imagerie, qui est aujourd'hui un domaine en pleine expansion
et fortement concurrentiel, afin d'évaluer leur réel potentiel d'attractivité pour les membres de
cette communauté scientifique. Ainsi, la majorité des (bio)molécules synthétisées ont été
conçues avec une volonté délibérée de fournir des stratégies hautement modulables et faciles à
mettre en œuvre, dans le but de fournir des solutions pertinentes et innovantes aux
problématiques associées à la synthèse et aux applications (bio)analytiques des sondes
fluorogéniques. Nous espérons ainsi que ces travaux pourront servir de point de départ mais
aussi de véritable "boîte à outils" aux actuels et futurs membres de notre équipe ainsi qu'aux
nombreux chercheurs (des secteurs académique et privé) travaillant dans le domaine des
sondes (bio)moléculaires "intelligentes".

Sommaire
Introduction générale

I.

Concepts généraux ..................................................................................26

II. Le principe d'une détection "fluorogénique" ...........................................30
1 Sondes fluorogéniques "ON-OFF" pro-fluorescentes..................................................................... 31
1.1. Quenching par modification de la structure du fluorophore ................................................. 31
1.2. Quenching par transfert d'électron photo-induit (PeT) ......................................................... 33
2 Les sondes FRET.............................................................................................................................. 34
2.1. Principe du FRET ..................................................................................................................... 34
2.2. Les "quencheurs" de fluorescence ......................................................................................... 36
2.3. Systèmes FRET (Fluorophore-Quencheur) comme sondes fluorogéniques de type "ON-OFF"
37

III. Présentation du projet de thèse et situation dans le contexte des travaux
de recherche du laboratoire. .........................................................................38
1.1. Projet de thèse initial et établissement d'une stratégie ........................................................ 38
1.2. Positionnement et contexte du projet au sein du laboratoire............................................... 41

Chapitre 1: Synthèse de nouvelles rhodamines non symétriques
hydrosolubles

I.

Etat de l'Art: ............................................................................................46
1 Optimisation des propriétés optiques de rhodamines en milieu biologiques: .............................. 47
1.1. Des rhodamines dans le Proche Infrarouge (NIR). ................................................................. 47
1.1.1 Modulation des propriétés optiques par modification de la conjugaison du système.... 48
1.1.2 Modulation des propriétés optiques des rhodamines par substitution de l'atome
d'oxygène du cœur xanthène. ................................................................................................... 51
1.2. Des rhodamines hydrosolubles .............................................................................................. 56
1.2.1 Hydrosolubilisation "post-synthétique" des rhodamines ................................................ 57
1.2.2 Les sulforhodamines......................................................................................................... 60

2 Synthèse de rhodamines non symétriques. ................................................................................... 62
2.1. A mi-chemin entre fluorescéine et rhodamine: les rhodols................................................... 63
2.2. Rhodamines/rosamines non symétriques, synthèse et utilisation en milieu biologiques..... 66
2.3. Fluorophores hybrides basées sur un cœur xanthène ........................................................... 70

II. Résultats et discussions ...........................................................................74
1 Etude des propriétés photophysiques des sulforhodamines ......................................................... 74
2 Synthèses d’analogues non symétriques de la sulforhodamine 101 ............................................. 76
2.1. Présentation de la stratégie de synthèse mise en œuvre ...................................................... 76
2.2. Article 1 : “Straightforward Access to Water-Soluble Unsymmetrical Sulfoxanthene Dyes:
Application to the Preparation of Far-Red Fluorescent Dyes with Large Stokes’ Shifts”.............. 79
3 Synthèse de nouvelles sulforhodamines par SNAr ......................................................................... 90
3.1. Présentation de la stratégie de fonctionnalisation envisagée ............................................... 90
3.2. Article 2 : "Easy Access to Unsymmetrical Sulforhodamines through Transition-Metal-Free
Amination of a Mono-Bromo Sulfoxanthene Dye" ....................................................................... 91
4 Conclusion et perspective à ces travaux ...................................................................................... 105

Chapitre 2: Synthèse de nouveaux quencheurs de fluorescence à
structure diazoïque

I.

Etat de l’Art ........................................................................................... 109
1 Propriétés chimiques et spectrales des azobenzènes : ................................................................ 109
1.1. Utilisation des l’industrie des colorants ............................................................................... 109
1.2. Propriétés chimiques et biologiques des azobenzènes........................................................ 110
1.3. Les azobenzènes comme quencheurs de fluorescence : ..................................................... 112
2 La synthèse des azo benzènes ...................................................................................................... 115
2.1. Méthodes de préparation des azobenzènes symétriques. .................................................. 116
2.2. Méthodes de préparation des azobenzènes non symétriques. ........................................... 117
2.3. Aménagement fonctionnels d’azobenzènes ........................................................................ 119
3 Synthèse et fonctionnalisation de quencheurs diazoïques : ........................................................ 120
3.1. Préparation des analogues commerciaux de la famille des BHQ : ....................................... 121
3.2. Aménagement fonctionnel des quencheurs de la famille des BHQ pour la bioconjugaison.
122

3.3. Amélioration des propriétés spectrales des quenchers diazoïques par modification
structurale : ................................................................................................................................. 124

II. Résultats et discussions ......................................................................... 127
1 Synthèse de nouveaux quencheurs bioconjugables et hydrosolubles :....................................... 127
1.1. Synthèse d’analogues du BHQ-3 : ........................................................................................ 127
1.1.1 Présentation de la problématique :................................................................................ 127
1.1.2 Article 3 : “Bioconjugatable Azo-Based Dark-Quencher Dyes: Synthesis and Application
to Protease-Activatable Far-Red Fluorescent Probes” ............................................................ 128
1.2. Synthèse des analogues de BHQ-1 : ..................................................................................... 143
1.2.1 Présentation de la problématique et des résultats majeurs obtenus :.......................... 143
1.2.2 Article 4 : "Straightforward synthesis of bioconjugatable azo dyes. Part 1: Black Hole
Quencher-1 (BHQ-1) scaffold"................................................................................................. 143
1.3. Synthèse des analogues de BHQ-2 : ..................................................................................... 151
1.3.1 Présentation de la problématique et des résultats majeurs obtenus :.......................... 151
1.3.2 Article 5 : "Straightforward synthesis of bioconjugatable azo dyes. Part 2: Black Hole
Quencher-2 (BHQ-2) scaffold"................................................................................................. 151
1.4. Synthèse d’analogues de DABCYL : ...................................................................................... 158
1.4.1 Présentation de la problématique et des résultats majeurs obtenus :.......................... 158
1.4.2 Article 6 : "Synthesis and biosensing applications of water-soluble 3-(2-benzimidazolyl)7-hydroxycoumarin dyes" ....................................................................................................... 159
2 Synthèse de Quenchers Universels incorporant le motif diazo : ................................................. 190
2.1. Synthèse d’un conjugué de quenchers diazoïques: ............................................................. 190
2.1.1 Présentation de la problématique :................................................................................ 190
2.1.2 Article 7: “Universal Dark Quencher Based on “Clicked” Spectrally Distinct Azo Dyes” 191
2.2. Développement d’une nouvelle famille de quencheurs diazoïques et hydrosolubles : ...... 196
2.2.1 Présentation de la problématique :................................................................................ 196
2.2.2 Article 8 : "Azo-Sulforhodamine Dyes: A Novel Class of Broad Spectrum Dark Quenchers"
................................................................................................................................................. 197
3 Conclusion et perspective à ces travaux : .................................................................................... 202

Chapitre 3: Développement de nouvelles sondes FRET à protéases

I.

Etat de l’Art : ......................................................................................... 209
1 Concept général des sondes FRET fluorogéniques....................................................................... 209

2 Illustration des concepts de sonde FRET par la détection d’enzymes: ........................................ 211
2.1. Détection d’hydrolases simples : rupture du lien Donneur-Accepteur :.............................. 212
2.1.1 Rupture directe du lien entre le donneur et l’accepteur : ............................................. 212
2.1.2 Utilisation de bras auto-immolables : ............................................................................ 219
2.2. Détection de ligases : formation du lien Donneur-Accepteur.............................................. 223
2.2.1 Détection de ligases par création d’un système FRET.................................................... 224
2.2.2 Aparte sur le « quenching » statique appliqué à la détection de ligases ....................... 226
2.3. Détection d’enzymes via une modulation de la distance Donneur-Accepteur ................... 229
3 Sondes FRET pour la détection de protéases ............................................................................... 231
3.1. Détection de protéases à sérine........................................................................................... 232
3.1.1 Mécanisme d’action des protéases à sérine .................................................................. 232
3.1.2 Détection de protéases à sérine par sondes FRET ......................................................... 233
3.1.3 Détection de l’uPA .......................................................................................................... 234
3.2. Détection de protéases à cystéine ....................................................................................... 236
3.2.1 Mécanisme d’action des sérines protéases ................................................................... 236
3.2.2 Détection de protéases à cystéine par mécanisme d’hydrolyse enzymatique .............. 237
3.2.3 Détection de protéase à cystéine par l’addition non-réversible du thiol de la cystéine
................................................................................................................................................. 241

II. Résultats et discussions : ....................................................................... 245
1 Préparation de sondes FRET "mono-substrats" pour la détection de protéases en milieux
biologiques ...................................................................................................................................... 245
1.1. Détection de l’urokinase à l'aide de sondes FRET de type «ON-OFF» ................................. 245
1.1.1 Sonde utilisant des quencheurs réactifs vis-à-vis de thiols ............................................ 245
1.1.2 Sonde utilisant une séquence ligation-oxime, amidification en processus "one-pot"
séquentiel ................................................................................................................................ 250
1.1.3 Sonde utilisant la réaction de Kondrat'eva .................................................................... 252
1.1.4 Article 8: "Kondrat’eva Ligation: DielsAlder-based Irreversible Reaction for
Bioconjugation" ....................................................................................................................... 254
1.2. Détection du PSA à l'aide de sondes FRET de type «ON-OFF » ............................................ 295
1.2.1 Sonde préparée via l'utilisation d'une résine hydrazine et mettant en jeu une réaction
de cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen, catalysée au Cu(I) ............................................... 296
1.2.2 Sonde préparée en utilisant une résine 2-chlorotrityle. ................................................ 299
1.3. Détection de la cathépsine B (CatB) à l'aide de sondes FRET de type « ON-OFF » .............. 305
1.3.1 Synthèse d'une sonde utilisant une lysine protégée sur sa chaîne latérale par un Dde 305
1.3.2 Résultats des validations de la sonde FRET sensible à CatB........................................... 306

2 Préparation de sondes "bi-substrats" pour la détection simultanée de deux protéases ............ 308
2.1. Synthèse d'une sonde "DUAL" PSA/uPA utilisant un réactif de bioconjugaison
hétérotrifonctionnel (ou tripode)................................................................................................ 308
2.1.1 Détails de la synthèse ..................................................................................................... 309
2.1.2 Tests in vitro réalisés sur la sonde "bi-substrats" uPA/PSA (SB1) .................................. 317
2.2. Synthèse d'une sonde "DUAL" CatB/uPA utilisant un quencheur hétérobifonctionnel ...... 320
2.2.1 Détails de la synthèse ..................................................................................................... 320
2.2.2 Etude de l'activation in cellulo ........................................................................................ 326
3 Conclusions et perspectives à ces travaux ................................................................................... 327

Chapitre 4: Développement de nouvelles sondes pro-fluofluorescentes pour la détection d'enzymes en milieu biologique

I.

Etat de l'art: .......................................................................................... 331
1 Utilisation de systèmes pro-fluorescents pour la détection d'hydrolases ................................... 331
1.1. Sondes pro-fluorescentes pour la détection d'amidases: .................................................... 332
1.2. Sondes pro-fluorescentes pour la détection d'esterases: .................................................... 335
1.3. Sondes pro-fluorescentes pour la détection de phosphatases: ........................................... 338
1.4. Sondes pro-fluorescentes pour la détection de sulfatases: ................................................. 339
1.5. Sondes pro-fluorescentes pour la détection de β-galactosidase ......................................... 341
2 Sondes pro-fluorescentes pour la détection de réductases ........................................................ 342
2.1. Sondes pro-fluorescentes pour la détection de NTR ........................................................... 343
2.2. Sondes pro-fluorescentes pour la détection de AzoR .......................................................... 347

II. Résultats et discussions ......................................................................... 353
1 Utilisation de rhodamines pour la détection d’AzoR via des systèmes pro-fluorescents............ 353
1.1. Modification structurale de la rhodamine 110 pour la détection d’AzoR dans des cultures
bactériennes. ............................................................................................................................... 353
1.1.1 Présentation du concept mis en œuvre ......................................................................... 353
1.1.2 Article 10 : “The first latent green fluorophores for the detection of azoreductase
activity in bacterial cultures”................................................................................................... 354
1.2. Valorisation de la sulforhodamine SR101-NaphtNH2 via la préparation de sondes profluorescentes pour l'imagerie de l'hypoxie ................................................................................. 358
1.2.1 Synthèse des pro-fluorophores ...................................................................................... 358
1.2.2 Validation in vitro et in cellulo des pro-fluorophores dérivés de la SR101-NaphtNH2 ... 360

2 Valorisation de nouveaux fluorophores à phénol via la synthèse de sondes pro-fluorescentes
pour la détection in vitro d'activités enzymatiques ........................................................................ 364
2.1. Utilisation de sulforhodols pour la synthèse de sondes à hydrolases ................................. 365
2.1.1 Développement de nouvelles sondes à estérase ........................................................... 365
2.1.2 Développement de nouvelles sondes à sulfatase .......................................................... 367
2.1.3 Développement de nouvelles sondes à phosphatase .................................................... 368
2.2. Utilisation de sulforhodols pour la synthèse de sondes à réductase ................................... 370
2.2.1 Détection de nitroréductases. ........................................................................................ 370
2.3. Détection d'Azoréductases................................................................................................... 374
3 Vers la synthèse de sondes bisubstrats:....................................................................................... 376
3.1. Co-détection de deux réductases:........................................................................................ 376
3.1.1 Synthèse de la sonde: ..................................................................................................... 376
3.1.2 Validation de la sonde in vitro ........................................................................................ 378
3.2. Un système FRET pro-fluorescent pour la co-détection d'une protéase et d'une activité AzoR
381
3.2.1 Stratégie envisagée: ....................................................................................................... 382
3.2.2 Synthèse de la sonde: ..................................................................................................... 383
4 Conclusions et perspectives à ces travaux ................................................................................... 387

Conclusions et perspectives

I.

Rappel des travaux effectués et conclusions ......................................... 391

II. Perspectives .......................................................................................... 399
1 Travaux éventuels pour l'amélioration des propriétés spectrales et physico-chimiques des
"quencheurs" diazoïques. ............................................................................................................... 399
2 Pour aller plus loin dans les sondes FRET ..................................................................................... 401
3 Sondes pro-fluorescentes pour une application théranostic ....................................................... 402

Chapitre 1

Introduction générale

Introduction générale
L'imagerie médicale regroupe un grand nombre de techniques développées dans le but de
restituer une image des constituants du corps humain. Le but recherché est de visualiser (de
manière direct ou indirecte) l'anatomie, la physiologie ou encore le métabolisme d'une partie
précise du corps humain. Les techniques d'imagerie non invasives constituent un atout
déterminant pour les médecins dans la compréhension, le diagnostic et le traitement de
nombreuses pathologies. Il n'existe pas de technique universelle, ainsi il peut s'avérer souvent
nécessaire de faire appel à plusieurs techniques pour visualiser une seule et même cible1. Un
phénomène physique est à l'origine de chacune des techniques développées jusqu'à ce jour ce
qui a donné lieu à plusieurs modalités d'imagerie dont les avantages et inconvénients respectifs
sont reportées dans le Tableau 1. Outre les phénomènes physiques mis en jeu, ces différentes
techniques se différencient par leur résolution, leur sensibilité, le temps d'acquisition d'image ou
encore le coût financier.
Tableau 1: Avantages et inconvénients des techniques d'imagerie médicale connues à l'heure actuelle.

Modalité d'imagerie
Echographie
(ultrasons)
Scanner
(Rayons X)

Résolution

Sensibilité

Profondeur

50 µm

Très faible

cm

50 µm

Très faible

10 à 100 µm

Faible

Pas de
limite

IRM
(électromagnétisme

Pas de
limite

)
TEP
TEMP

1 à 2 mm

Elevée

2 à 3 mm

Très élevée

Pas de
limite

(radioactivité)
Imagerie optique
(luminescence)

1 à 10 cm

Quantificatio

Echelle

n

de temps

-

1 à 5 min

Moyen

-

1 à 5 min

Moyen

+

+++
++

++

10 s à 10
min

10 min
15 min
1sà5
min

Cout

Elevé

Elevé

Moyen

Depuis près de 10 ans, notre équipe de recherche a orienté ses travaux dans le domaine de
l'imagerie moléculaire optique en se focalisant sur le développement de nouveaux outils
chimiques destinés à concevoir des agents d'imagerie chémiluminescents ou fluorescents.
Comme cela est précisé dans le tableau ci-dessus, l'imagerie optique possède l'avantage de
1

Bai, J.; Liu, F.; Liu, X. Curr. Med. Imaging Rev., 2012, 8, 295-301.

25

Introduction générale
fournir des images dans un temps très court avec une sensibilité très élevée (de l'ordre du
picomolaire pour la fluorescence et de l'ordre du femtomolaire pour la bioluminescence). Elle
est par ailleurs l'une des modalités les moins onéreuses. Malgré tout, une faible résolution
spatiale ajoutée à une profondeur de champ médiocre ont conduit les chercheurs à étudier les
moyens possibles pour pallier ces défauts. Cette introduction générale a pour but de rappeler les
grands principes et les notions essentielles pour bien comprendre les enjeux actuels liés à la
recherche dans le domaine des agents de contraste fluorescents. Ceci justifiera également les
orientations choisies au cours de mes travaux de thèse.

I. Concepts généraux
Sous excitation photonique, les électrons d’une molécule peuvent passer dans un état excité, ce
qui se traduit par une transition de l'état fondamental S0 à un état Sn>02. Cet état instable
s'accompagne obligatoirement d'un retour à l'état fondamental S0 qui peut se produire via
différents processus résumés Figure 1.

Figure 1: Conséquences possibles du retour à l'état fondamental d'une molécule sous excitation photonique

Parmi les phénomènes présentés, la luminescence est l'aptitude d'une molécule à revenir à son
état fondamental via l'émission de lumière. Deux grands types de luminescence peuvent être
distingués: la fluorescence et la phosphorescence. L'état excité de la molécule se situe le plus
souvent à un niveau intermédiaire entre les niveaux Sn et Sn+1. Une première transition se
produit alors sous la forme de conversion interne permettant le passage de l'état Sn,n à l'état Sn.
Cette transition est non radiative, c'est-à-dire qu'elle ne s'accompagne pas d'une émission de
photons. En revanche lors du retour de la molécule à son état fondamental via la transition (Sn
⟶ S0), le surplus d'énergie emmagasiné est restitué sous forme de lumière. C'est ce phénomène
2

Lakowicz, J. R. Principle of Fluorescence Spectroscopy - Third Edition, Vol., Springer ed., 2007

26

Chapitre 1

Introduction générale
qui est appelé fluorescence et toute molécule répondant à ces caractéristiques est appelée
fluorochrome ou fluorophore. Dans le cadre de notre étude, nous nous cantonnerons à l'étude de
fluorophores organiques c'est à dire des molécules ne mettant pas en jeu des complexes
métalliques (de cations lanthanide par exemple). Il est à préciser que le passage d'un état
singulet Sn à un état triplet Tn peut avoir lieu dans certains cas particuliers via un une transition
appelée croisement inter-système. De la même manière le retour de la molécule à son état
fondamentale S0 passe par une conversion interne non radiative (T1,1 ⟶ T1) puis par une
transition (T1 ⟶ S0) via une émission de lumière beaucoup plus persistante dans le temps. C'est
ce phénomène très proche et souvent confondu avec la fluorescence qui est appelé
phosphorescence. L'ensemble de ces transitions est schématisé dans le diagramme de PerrinJablonski (simplifié) reporté Figure 2.

Figure 2: Diagramme de Perrin Jablonski simplifié décrivant les niveaux électroniques de molécules organiques et les
3
transitions possibles entre différents états d'excitation singulets et triplets (figure extraite directement du livre ).

Le rayonnement résultant du retour à l'état fondamental d'une molécule est émis à un niveau
d'énergie inférieur à celui d'excitation du fluorophore. Ceci se caractérise par un spectre
d'émission dont le maximum se situe à une longueur d'onde supérieure à celle du spectre
d'absorption. La différence entre les maxima d'absorption et d'émission constitue un des
paramètres qui caractérisent les propriétés de fluorescence d'une molécule appelée
déplacement de Stokes. L'autre grandeur particulièrement importante renseigne sur le nombre
de photons émis par rapport au nombre de photons absorbés et se nomme le rendement
quantique de fluorescence (QY ou φ). Le produit de ce QY avec la valeur de son coefficient
d'extinction molaire (ε) donne la valeur de la brillance (B) d'un fluorophore qui renseigne ainsi à
3

Sauer, M.; Hofkens, J.; Enderlein, J. Handbook of Fluorescence Spectroscopy and Imaging - From Single
Molecules to Ensembles, Vol., 2011

27

Chapitre 1

Chapitre 1

Introduction générale
la fois sur l'aptitude d'un fluorophore à être excité et sur l'efficacité de la fluorescence qui en
résultera. La valeur du QY est calculée de manière théorique par l'équation faisant intervenir les
constantes de vitesse de transition radiative et non radiatives respectivement kr et knr.
L'utilisation de ces deux constantes permet aussi le calcul de la durée de vie du fluorophore qui
traduit le temps nécessaire à la disparition totale de molécules excitées suite à une excitation
photonique ou en d'autre termes la durée durant laquelle il est possible de détecter un signal
lumineux après excitation du fluorophore. La valeur comunément utilisée pour caractériser ce
phénomène est le temps de demi-vie (߬௙ ). La Figure 3 rassemble l'ensemble des équations et
données fondamentales qui permettent de définir les propriétés photophysiques d'un
fluorophore.
Déplacement de Stokes
λ Max(Abs)

λ Max(Em)

Spectre D’absorption

Spectre D’émission

Longueur d'onde
Absorbance

ܻܳ =

݇‫ݎ‬
݇ ‫ ݎ‬+݇ ݊‫ݎ‬

݂߬ =

1
݇‫ ݎ‬+ ݇݊‫ݎ‬

Emission

‫ߝ × ܻܳ = ܤ‬

Figure 3: Représentation des spectres d'absorption et d'émission de fluorophore.

La valeur des grandeurs dont nous venons de parler sont influencées par de nombreux
paramètres dont la nature du milieu dans lequel les fluorophores sont en solution. Ainsi les
longueurs d'onde d'absorption/émission varient de manière non négligeable en fonction du
solvant utilisé via un phénomène appelé solvatochromisme4. Le rendement quantique peut lui
aussi être altéré dans le cas de formation d'exciplexes ou d'agrégats de fluorophores (souvent
induit par une solubilité non optimale) qui se traduit par une chute drastique de l'efficacité de
fluorescence. Or ces fluorophores sont principalement développés pour détecter/imager des
phénomènes chimiques ou biologiques dans des fluides biologiques complexes ou au sein même
d'organismes vivants. Ceci implique de disposer d'espèces fortement fluorescentes en milieu
aqueux. Par ailleurs dans l'optique d'avoir un signal facile à détecter dans des milieux
4

Klymchenko, A. S.; Mely, Y. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 2013, 113, 35-58.

28

Chapitre 1

Introduction générale
biologiques complexes où les "parasites" capables d'absorber les photons sont légion, il est
nécessaire d'améliorer le paramètre "profondeur" évoqué dans le Tableau 1. Cette valeur peut
être

augmentée

de manière

significative en fonction de

la

valeur des

maxima

d'absorption/émission du fluorophore utilisé. Ainsi la zone du proche infrarouge (NIR)5 du
spectre visible schématisée Figure 4 (encore appelé fenêtre thérapeutique) est la plus adaptée
car elle combine à la fois une faible auto-fluorescence des tissus vivants et une faible absorption
par les différents constituants du vivant, ce qui se traduit par une pénétrabilité élevée qui
permet d'obtenir un rendu optimal via un rapport signal sur bruit nettement accru notamment
lors d'expériences réalisées in vivo.

Figure 4: Coefficient d'extinction des principaux milieux biologiques que l'on trouve dans des organismes vivants et
6
représentation de la zone NIR du spectre visible (figure extraire de l'article de Hisataka Kobayashi et al. ).

Il est ainsi possible d'obtenir une profondeur de l'ordre quelques centimètres permettant des
expériences d'imagerie sur le petit animal. L'optimisation de tous ces paramètres au sein d'une
même molécule est une quête à laquelle les chercheurs de nombreux groupes académiques ou
de sociétés de biotechnologies à travers le monde, se sont attachés depuis des années. Ceci a
donné lieu à une quantité innombrable d'articles et de brevets décrivant la structure, la synthèse
et les propriétés photophysiques de plusieurs centaines de fluorophores organiques. Ces
molécules sont réparties dans différents familles qui se distinguent par leurs structures
chimiques. Parmi les plus connues, on peut citer les xanthènes (rhodamines et fluorescéines), les

5

(a) Frangioni, J. V. Curr. Opin. Chem. Biol., 2003, 7, 626-634. (b) Hilderbrand, S. A.; Weissleder, R. Curr.
Opin. Chem. Biol., 2010, 14, 71-79. (c) Nolting, D. D.; Gore, J. C.; Pham, W. Curr. Org. Synth., 2011, 8, 521534. (d) Pansare, V. J.; Hejazi, S.; Faenza, W. J.; Prud'homme, R. K. Chem. Mater., 2012, 24, 812-827. (e)
Ptaszek, M. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 2013, 113, 59-108.
6
Kobayashi, H.; Ogawa, M.; Alford, R.; Choyke, P. L.; Urano, Y. Chem. Rev., 2010, 110, 2620-2640.

29

Introduction générale
coumarines, les cyanines (et leurs analogues comme les squaraines par exemple) ou encore les
BODIPYs (Figure 5)7.
.

Figure 5: Principales familles de fluorophores organiques décrites dans la littérature

Ces structures sont très générales. Depuis les années 1990, de nombreux travaux ont porté sur
les modifications structurales de ces fluorophores afin d'optimiser leurs propriétés
photophysiques mais aussi physico-chimiques (solubilité dans l'eau ou photoblanchiement par
exemple) et "biologiques" (cytotoxicité et pénétration cellulaire par exemple). Il est ainsi délicat
de classer ces fluorophores par gamme spectrale (la plupart des familles, mis à part peut-être les
coumarines, possédant des composés couvrant la quasi-totalité du spectre visible aussi bien en
absorption qu'en émission). Les valeurs présentées Figure 5 sont présentées à titre indicatif.
Elles font référence aux fluorophores usuels et ne font pas état de structures complexes très
spécifiques qui ont pu être publiées plus récemment dans la littérature. Si l'utilisation première
de ces fluorophores fut principalement dédiée au marquage peu ou pas ciblé de tissus ou de
cellules au sein d'organismes pour pouvoir les visualiser, une meilleure compréhension de la
relation structure/propriété photophysiques de ces fluorophores a permis d'utiliser ces
marqueurs pour détecter des (bio)analytes d'intérêt et les processus (bio)chimiques dans
lesquels ils sont impliqués, selon un schéma de détection "fluorogénique" dont nous allons
débattre dans la suite de cette introduction.

II. Le principe d'une détection "fluorogénique"

7

(a) Lavis, L. D.; Raines, R. T. ACS Chem. Biol., 2008, 3, 142-155. (b) Lavis, L. D.; Raines, R. T. ACS Chem.
Biol., 2014, 9, 855-866.

30

Chapitre 1

Introduction générale
S'il y a un avantage certain à l'utilisation de fluorophores organiques, c'est que leurs propriétés
photophysiques sont intimement liées à leur structure chimique. Ainsi, il est possible
d’envisager une modulation de ces propriétés par aménagement fonctionnel ou modification du
squelette du fluorophore. Cette caractéristique donne l'opportunité d'éteindre la fluorescence
(ou de la moduler) par des réactions chimiques ou enzymatiques bien ciblées. C'est ainsi que le
concept de substrats/sondes fluorogéniques8 est né dans les années 19609. On parle aussi de
chemodensimètres fluorescents, de sonde activables ou encore de sondes intelligentes. Cette
stratégie (par comparaison avec celle fondée sur un simple marquage fluorescent de la cible à
étudier10) possède l'avantage d'augmenter considérablement le rapport signal sur bruit lors
d'expériences d'imagerie réalisées dans des milieux biologiques complexes. Elle permet en outre
de cibler de manière beaucoup plus précise les phénomènes biologiques ou chimiques au sein
d'organismes, chose bien plus complexe à réaliser avec les agents d'imagerie conventionnels.
Deux méthodes majeures peuvent être distinguées : les sondes "ON-OFF" utilisent l'apparition
(ou la disparition) du signal fluorescent alors que c'est une modulation de la longueur d'onde du
signal fluorescent qui est mise à profit par les sonde "ratiométriques". Lors de ma thèse, nous
nous somme essentiellement intéressés à l'approche "ON-OFF par conséquent, les sondes
ratiométrique ne seront pas développées dans la suite du manuscrit. Le paragraphe qui va suivre
n'a pas pour objectif de faire un descriptif de tous les travaux de la littérature dans ce domaine
mais plutôt d'expliquer les concepts mis en œuvre dont certains ont été employés lors de mes
travaux de thèse. Le Chapitre 3 consacré aux sondes FRET ainsi que le Chapitre 4 consacré aux
sondes pro-fluorescentes pour la détection d'activités enzymatiques débuteront par un état de
l'art appliqué aux problématiques précises visées lors de cette thèse. Pour chacun de ces
Chapitres, les travaux de la littérature dans ce domaine seront présentés en détails. Afin de bien
fixer les objectifs de mes travaux de thèse, il est malgré tout nécessaire de présenter ici certains
principes fondamentaux qui régissent la détection fluorogénique.

1 Sondes fluorogéniques "ON-OFF" pro-fluorescentes
1.1. Quenching par modification de la structure du fluorophore

8

Pour des revues sur le sujet, voir: (a) Johnson, I. Histochem. J., 1998, 30, 123-140. (b) Lakowicz, J. R. Topics
in Fluorescence Spectroscopy, Vol. Volume 4 - Probe Design and Chemical Sensing, 2002. (c) Chen, X.; Sun,
M.; Ma, H. Curr. Org. Chem., 2006, 10, 477-489. (d) Johnsson, N.; Johnsson, K. ACS Chem. Biol., 2006, 31-38.
(e) Terai, T.; Nagano, T. Curr. Opin. Chem. Biol., 2008, 12, 515-521. (f) Nagano, T. Proc Jpn Acad Ser B Phys
Biol Sci, 2010, 86, 837-847. (g) Chan, J.; Dodani, S. C.; Chang, C. J. Nat. Chem., 2012, 4, 973-984. (h) Grimm,
J. B.; Heckman, L. M.; Lavis, L. D. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 2013, 113, 1-34. (i) Terai, T.; Nagano, T.
Pflugers Arch, 2013, 465, 347-359. (j) Li, X.; Gao, X.; Shi, W.; Ma, H. Chem. Rev., 2014, 114, 590-659.
9
(a) Rotman, B.; Papermaster, B. W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1963, 1-6. (b) Rotman, B.; Papermaster, B.
W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1966, 134-141.
10
Takaoka, Y.; Ojida, A.; Hamachi, I. Angew. Chem., Int. Ed., 2013, 52, 4088-4106.

31

Chapitre 1

Introduction générale
La plus simple (et la plus drastique) des modifications de signal est l'extinction (ou l'apparition)
de la fluorescence d'un colorant organique. Ainsi l'analyte ciblé joue le rôle d'interrupteur qui
allume (ou éteint) la fluorescence du système. Ce concept est à rapprocher de celui utilisé en
chimie thérapeutique avec les pro-drogues (dans lesquelles c'est le principe actif qui est libéré
suite à une ou plusieurs réaction(s) chimiqu(e) généralement induite(s) par une enzyme) et il
est appelé pro-fluorescence. Le terme de pro-fluorophore (synonyme de sonde profluorescente) a été introduit par le Professeur Ronald T. Raines en 200511 ; on rencontre
également parfois le terme de fluorophore latent ("latent fluorophore") pour désigner ce type de
sondes. Un grand nombre de travaux relatifs aux sondes pro-fluorescentes sont publiés de façon
hebdomadaire car ce sont des outils qui sont couramment utilisés dans les tests/analyses
(bio)chimiques mis en œuvre dans de nombreuses applications: diagnostic in vitro,
biotechnologie enzymatique, enquêtes médico-légales, analyse environnementale et plus
récemment dans le domaine de l'imagerie moléculaire in vivo et des tests sur cellules vivantes.
Un exemple simple permettant d'illustrer ce concept est la différence qui existe entre la forme
ouverte fluorescente de la rhodamine 110 (R110) et sa forme spirolactonisée (aussi appelée
fermée) pour laquelle il n'existe plus de conjugaison du système polyaromatique. La
conséquence étant l'absence totale de fluorescence verte12. L'exemple présenté Figure 6 montre
l'utilisation d'une réaction de sulfonylation des deux anilines de R110 qui n'est possible que sur
la forme lactonisée de cette rhodamine (pour laquelle les deux anilines sont libres et donc
nucléophiles). Le produit ainsi formé se trouve sous sa forme fermée non fluorescente. Les thiols
peuvent réagir par substitution nucléophile aromatique (SNAr, addition-élimination) avec départ
de dioxyde de soufre (SO2) permettant de redonner la rhodamine de départ fluorescente. Ce profluorophore développé par le groupe de Hiroshi Abe13 a permis la détection fluorogénique de
thiols biologiques lors d'expériences in cellulo sur des cellules HeLa (Figure 6).
.

11

Chandran, S. S.; Dickson, K. A.; Raines, R. T. J. Am. Chem. Soc, 2005, 1652-1653.
Pour des revues, voir: (a) Chen, X.; Pradhan, T.; Wang, F.; Kim, J. S.; Yoon, J. Chem. Rev., 2012, 112, 19101956. (b) Zheng et al. Chem. Commun. 2013, 49, 429
13
Shibata, A.; Furukawa, K.; Abe, H.; Tsuneda, S.; Ito, Y. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18, 2246-2249.
12

32

Chapitre 1

Chapitre 1

Introduction générale

13

Figure 6: Principe de la sonde à thiol développée par Hiroshi Abe (clichés extraits de l'article)

Dans le cas que nous venons d'évoquer, l'extinction de fluorescence est obtenue par une
modification structurale. Ceci n'est pas toujours le cas. Certain exemples utilisent un quenching
du fluorophore par transfert d'électron photo-induit (PeT).

1.2. Quenching par transfert d'électron photo-induit (PeT)
Le phénomène de PeT consiste en un transfert monoélectronique entre un fluorophore à l'état
excité et un groupement "quenchant" pour lequel le niveau de la HOMO ou de la LUMO se situe
entre la HOMO et la LUMO du fluorophore excité. Le niveau d'enrichissement en électrons du
groupement "quenchant" donne lieu à deux mécanismes différents présentés Figure 7. Il sera
alors possible de distinguer un PeT de type réducteur si le groupement quenchant est riche en
électrons ou oxydatif si ce groupement est pauvre en électrons14.

Figure 7: Présentation du phénomène de Transfert d'électron photo-induit (PeT)

D'une manière générale le résultat de ces deux phénomènes (PeT réducteur ou oxydatif) est que
l'électron situé sur la LUMO du fluorophore ne revient pas directement à son état fondamental
(sur la HOMO). Il n'y a donc pas de fluorescence observée, en tout cas pas à la longueur d’onde
excomptée. Pour citer un exemple illustratif, en 2004, le groupe de Tetsuo Nagano15 présente la
14
15

Zhang, W.; Ma, Z.; Du, L.; Li, M. Analyst, 2014, 139, 2641-2649.
Gabe, Y.; Urano, Y.; Kikuchi, K.; Kojima, H.; Nagano, T. J. Am. Chem. Soc., 2003, 3357-3367.

33

Introduction générale
structure d'un BODIPY portant en position meso un substituant 3,4-diaminophényle (enrichi en
électrons) qui "quenche" la fluorescence par PeT réductif (Figure 8). Sous l'action du monoxyde
d'azote (NO) et via une séquence Nitrosation/SEAr, un BODIPY-benzotriazole est obtenu ne
présentant plus le phénomène de PeT vers le cœur fluorescent. La fluorescence native du
BODIPY est alors recouvrée.

Figure 8: Principe de la sonde à oxyde nitrique développé par Tetsuo Nagano.

Par analogie avec l'exemple présenté Figure 6, cette étude montre que l'une des stratégies
actuellement privilégiée pour détecter/imager des (bio)analytes d'intérêt (typiquement des
petites (bio)molécules ou des ions métalliques) est celle qui tire parti de la réactivité intrinsèque
de l'analyte lui-même pour libérer/former in situ le fluorophore selon des processus plus ou
moins complexes (rupture d'une liaison covalente, formation de liaison(s) covalente(s) ou
métal-ligand ou processus domino)16. Une autre approche utilise des ensembles moléculaires
associant deux chromophores au sein d'une paire de FRET.

2 Les sondes FRET
2.1. Principe du FRET
Le FRET17 (Förster Resonance Energy Transfer) est un transfert de type dipôle-dipôle entre
deux partenaires appelés donneur et accepteur. C’est un mécanisme distinct du phénomène de
quenching statique, correspondant, lui, à la formation d’exciplexes ou de complexes non
fluorescents (« ground state complexes »)2,18 entre deux fluorophores par interactions
électrostatiques. Il faut aussi le distinguer du quenching de Dexter19, où le transfert d’énergie
s’effectue par interaction collisionnelle. L'excitation du donneur permet le passage de
16

(a) Jun, M. E.; Roy, B.; Ahn, K. H. Chem. Commun, 2011, 47, 7583-7601. (b) Chan, J.; Dodani, S. C.; Chang,
C. J. Nat. Chem., 2012, 4, 973-984. (c) Shi, W.; Ma, H. Chem. Commun, 2012, 48, 8732-8744. (d) Grimm, J. B.;
Heckman, L. M.; Lavis, L. D. In Progress in Molecular Biology and Translational Science; Vol. Volume 113;
Chapter One - The Chemistry of Small-Molecule Fluorogenic Probes; 2013; May, C. M.
17
(a) Förster, T. Discuss. Faraday. Soc, 1959, 27, 7. Sapsford, K. E.; Berti, L.; Medintz, I. L. Angew. Chem. Int.
Ed, 2006, 45, 4562-4589. (b) Clegg, R. M. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol.
Chapitre 3 Förster resonance energy transfer—FRET what is it, why do it, and how it’s done, 2009
18
(a) Wang, Y.; Haze, O.; Dinnocenzo, J. P.; Farid, S.; Farid, R. S.; Gould, I. R. J. Org. Chem, 2007, 72, 69706981. (b) Liang, J.; Nguyen, Q. L.; Matsika, S. Photochemical & Photobiological Sciences, 2013, 12, 13871400.
19
Dexter, D. L. J. Chem. Phys., 1951, 21, 836–850

34

Chapitre 1

Introduction générale
l’accepteur de son état fondamental à un état excité conduisant de l’état (1) à l’état (2) du
système FRET présenté Figure 9. Lors de son retour à l'état fondamental, le donneur transfère
ainsi de l'énergie à l'accepteur via un phénomène de transfert d'énergie non radiatif.

Figure 9: Principe du FRET

Ce transfert induit une excitation de l'accepteur pour obtenir un état générale (2) du système. Le
retour à l'état fondamental de l'accepteur vers l'état au repos du système FRET (3) peut
s'accompagner d'une émission de lumière hν' en fonction de la nature de l'accepteur
(fluorophore ou simple chromophore agissant comme "quencher"). Le FRET nécessite deux
paramètres importants. Le premier est qu'il n'est possible que lorsque les deux partenaires sont
suffisamment proches l'un de l'autre (distance en général comprise entre 10 et 100 Angströms),
l’efficacité du transfert d’énergie étant, suivant la théorie de Förster, dépendante en 1/d6 de la
distance d entre les deux partenaires. Cette distance est typiquement de l’ordre de grandeur des
distances mises en jeu dans les phénomènes d’interaction entre deux biomolécules, ce qui fait de
ce transfert d’énergie un outil clef dans l’étude des biomolécules et de leurs interactions. Le
second est que le spectre d'émission du donneur doit se superposer (du moins en partie) avec le
spectre d'absorption de l'accepteur de la paire de FRET comme cela est schématisé Figure 10. Un
alignement des moments dipolaires est également un élément limitant dans ce phénomène de
FRET.

Spectre Absorption de l'accepteur
Spectre d'émission de l'accepteur
Spectre d'absorption du donneur
Spectre d'émission de l'accepteur

Longueur d'onde (nm)

35

Chapitre 1

Introduction générale
Figure 10: Paramètres nécessaires pour l'établissement d'un transfert de type FRET

Plusieurs situations sont possibles. Premièrement, la paire de FRET peut être composée de deux
chromophores identiques conduisant à un transfert de type Homo-FRET se traduisant par un
quenching du système. Lorsque les deux composants sont différents, deux cas sont possibles.
Dans le premier, le donneur et l'accepteur sont tous les deux des fluorophores. Dans ce cas, c'est
l'émission de l'accepteur par excitation du donneur à l'issue du transfert d'énergie, qui est
observée. En revanche, si l'accepteur est une entité capable de dissiper l'énergie emmagasinée et
ce de manière non radiative, se produit alors un phénomène d'extinction du fluorophore qui
n'est plus dû à une modification de sa structure propre mais à un transfert de son énergie vers
une autre entité alors appelée "quencheur".

2.2. Les "quencheurs" de fluorescence
Les quencheurs de fluorescence sont répartis en deux grandes familles se différenciant
essentiellement par le phénomène mis en jeu dans le mécanisme de "quenching". La dissipation
de l’énergie absorbée peut se faire soit par transfert électronique au sein du squelette du
"quencheur" (cas des "quencheurs" par transfert interne de charge (ICT) ou par PeT) ou alors
par mouvement moléculaire se traduisant, par exemple, par une photo-isomérisation (Z/E) de la
double liaison -N=N- des "quencheurs" de type diazoïques. Cette dernière famille fera l'objet
d'un état de l'art approfondi dans le Chapitre 2. Les quencheurs fonctionnant par PeT ou ICT
regroupent essentiellement des molécules dont les structures sont inspirées de celles de
fluorophores auxquels ont été greffés des groupements électro-donneur ou attracteur de
manière à inhiber la fluorescence native du fluorophore. Parmi les quencheurs les plus utilisés,
on retrouve des dérivés de cyanines (famille des CyDye™Q20 et IRDye QC121 commercialisés
respectivement par GE Healthcare et LI-COR Biosciences) et de N,N'-diarylrhodamines (famille
des QSY22 commercialisés par Life Technologies, anciennement Invitrogen-Molecular Probes).
Les réactifs commerciaux sont souvent fonctionnalisées sous la forme d'un ester activé de type
N-hydroxysuccinimidyle (NHS) mais nous avons délibérément représenté les formes acide
carboxylique Figure 11. Chacune de ces molécules est décrite avec son maximum d'absorption
(λAbsMax), sa gamme effective de "quenching" ("quenching range" ou QR) ainsi que son
coefficient d'extinction molaire.
20

(a)
GE
Healthcare
Product
Booklet,
Vol.
PA75100PL
Rev
C,
2006,
p.
http://www.gehealthcare.com/lifesciences; (b) O. Redy, E. Kisin-Finfer, E. Sella, D. Shabat, Org. Biomol. Chem.
2012, 10, 710-715.
21
Peng, X.; Chen, H.; Draney, D. R.; Volcheck, W.; Schutz-Geschwender, A.; Olive, D. M. Anal. Biochem,
2009, 388, 220-228.
22
(a) R. P. Haugland, V. L. Singer, S. T. Yue, (Molecular Probes, Inc.), US6,399,392 B1, 2002. (b) Y. Kong, H.
Yao, H. Ren, S. Subbian, S. L. G. Cirillo, J. C. Sacchettini, J. Rao, J. D. Cirillo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010,
107, 12239-12244. Un autre quencheur appelé QS35 est commercial qui n'est pas derivé d'une structure de
rhodamine mais de nitrobenzoxadiazole (NBD).

36

Chapitre 1

Chapitre 1

Dérivés de rhodamines

Introduction générale

N

N+

O

N

N+

O

N

O

S

O
N

O

S

O
N

O

OH

O
N
OH

O

QSY 7
= 560 nm
QR = 500 - 600 nm
= 90 000 L.mol-1.cm-1

O

QSY 9
= 562 nm
QR = 500 - 600 nm
= 85 000 L.mol-1.cm-1

AbsMax

QSY 21
= 660 nm
QR = 590 - 720 nm
= 89 000 L.mol-1.cm-1

AbsMax

AbsMax

SO3Na

SO3Na

Dérivés de cyanines

S

OH

O

-

N+

O

SO3-

HO3S

SO3-

O3S

N
NaO3S

N+

Cl
N+

N

N

NO2
SO3O2N

HO2C

HO2C

Cy5Q
= 665 nm
QR = 600 - 700 nm*
= 170 000 L.mol-1.cm-1

IRDye QC1
= 788 nm
QR = 500 - 800 nm
= 96 000 L.mol-1.cm-1

AbsMax

AbsMax

Figure 11: Structures des principaux quencheurs commerciaux fonctionnant par PeT ou ICT

Les propriétés spectrales des tous ces quencheurs dénotent une certaine efficacité de quenching
en particulier de par leur coefficients d’extinction molaire particulièrement élevés. Néanmoins,
si les dérivés QSY jouissent d’une stabilité (photo)chimique importante (ce qui est une
caractéristique majeure des chromophores/fluorophores à cœur xanthène), ce n’est pas le cas
du Cy5Q et de l'IRDye QC1 qui (du fait de leur chaîne polyméthine) sont très sensibles aux
conditions chimiques (réduction, sensibilité au pH) et de stockage (température, lumière,
oxygène, photoblanchiement)

2.3. Systèmes FRET (Fluorophore-Quencheur) comme sondes fluorogéniques
de type "ON-OFF"
Le FRET induit un grand nombre de comportements possibles qui seront développés plus en
détails dans l'introduction du Chapitre 3. Néanmoins, et afin de mieux comprendre les objectifs
initiaux de cette thèse, j'ai décidé de présenter ici un exemple de sonde FRET à protéase
développé par le groupe de Mathew Bogyo23 dans laquelle la fluorescence de la sulfoindocyanine
Cy5.0 est quenchée par le QSY 21 via un transfert de type FRET.

23

Edgington, L. E.; Verdoes, M.; Ortega, A.; Withana, N. P.; Lee, J.; Syed, S.; Bachmann, M. H.; Blum, G.;
Bogyo, M. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135, 174-182.

37

Chapitre 1

Introduction générale
Fluorophore: Cy5.0
HO3S

Fluorophore: Cy5.0

SO3H

N+

HO3S

N

SO3H
FR
E

N+

T

HO2C

N

O
CO2H

NH O
O
N
N+

HO2C

O

CO2H

NH O
N
H

S
O

HS
O

O
N

N
H

N

O

O

H
N

O
O

Site électrophile

3

N

H
N
O

O2
S

Legumain

Quencheur: QSY 21

N+

O

N

groupe partant
O
-O

H
N
O

6

N

H
N
O

O2
S

Quencheur: QSY 21

23

Figure 12: Principe de la sonde FRET pour la détection de Legumain développée par Matthew Bogyo

Après action de la légumaine24, le lien entre le fluorophore et le quencheur est rompu ne
permettant plus le FRET et induisant la libération de la fluorescence de la cyanine. La légumaine
est une protéase à cystéine surexprimée dans les cellules tumorales du cancer du sein. Cette
sonde de type "suicide" engendre un marquage de la protéine. Cette stratégie possède
néanmoins l'inconvénient de ne pas pouvoir profiter du caractère catalytique des réaction
enzymatiques car l'enzyme est consommée et inhibée lors de la réaction. Malgré tout cette sonde
peut servir pour la détection de légumaine et par extension pour un éventuel diagnostic du
cancer du sein dans lequel cette enzyme est impliquée. D'autres cancers comme celui de la
prostate sont à l'heure actuelle beaucoup étudiés et utilisent des méthodes de diagnostic qui
conduisent à un nombre important de faux positifs. Or, il est désormais connu que cette
pathologie induit la surexpression simultanée de plusieurs protéases. Ainsi la co-détection de
deux enzymes pourrait permettre d'abaisser le nombre de faux positifs et ainsi d'affiner le
diagnostic. C'est dans l'optique de développer/valider des sondes FRET capables de détecter en
simultané deux activités enzymatiques qu'ont été effectués mes travaux de thèse.

III. Présentation du projet de thèse et situation dans le
contexte des travaux de recherche du laboratoire.
1.1. Projet de thèse initial et établissement d'une stratégie
L'idée générale pour réaliser la détection simultanée de deux protéases via l'utilisation d'une
architecture moléculaire unique est de faire coexister en son sein un peptide 1 substrat d'une
protéase 1, un peptide 2 substrat d'une protéase 2, respectivement marqués avec un
fluorophore différent (c'est-à-dire présentant une émission dans deux gammes spectrales bien
24

(a) Liu, C.; Sun, C.; Huang, H.; Janda, K.; Edgington, T. Canc. Res., 2003, 63, 2957-2964. (b) Liu, Y.; Bajjuri,
K. M.; Liu, C.; Sinha, S. C. Mol. Pharm., 2011, 9, 168-175.

38

Chapitre 1

Introduction générale
distinctes). L'ensemble devra être lié à un quencheur large bande capable d'annihiler la
fluorescence des deux fluorophores utilisés selon le schéma présenté Figure 13
peptide 1

FR
ET

peptide 2

ET
FR

Q

Protéase1

Protéase 2
Protéase 1
+
Protéase 2

peptide 2

tide 1

pep

de 2

Q
Détection de la protéase 1
couleur 1

peptide 1

pepti

Q
Co-Détection des 2
protéases: couleur 3

Détection de la protéase 2
couleur 2

Figure 13: Principe de la sonde "bi-substrats" pour la détection simultanée de deux protéases.

L'analyse des problèmes associées à l'établissement d'une stratégie de synthèse permettant
l'obtention d'une telle sonde a permis d'identifier plusieurs points indépendants à étudier. Le
premier est de trouver un moyen d'associer avec des taux de conversion et des rendements
corrects des ensembles moléculaires complexes hautement fonctionnalisés. La bioconjugaison
qui consiste en la liaison de plusieurs biomolécules entre elles ou le marquage de biomolécules
avec des molécules organiques d'intérêt a donné lieu à un grand nombre de travaux ces
dernières années25. Les travaux du laboratoire ont conduit à la synthèse de "tripodes", nom
donné à des réactifs de bioconjugaison hétérotrifonctionnel (il est aussi possible de parler de
plateforme moléculaire trivalente) qui tirent parti de la présence de trois fonctions
bioconjugables, qui coexistent à l'état libre (c'est-à-dire totalement déprotégées), pour effectuer
trois réactions de dérivatisation selon des approches séquentielles "trois étapes" ou "one-pot"
facilitant l'accès à des édifices (bio)moléculaires complexes. Ces travaux principalement
effectués lors de la thèse du Docteur Guillaume Clavé entre 2006 et 2009 dans le cadre d'une
collaboration fructueuse avec des laboratoires du CEA-Saclay et du Leti du CEA-Grenoble, ont

25

Pour des revues et ouvrages récents et complets sur le sujet, voir: (a) Hermanson, G. T. Bioconjugate
Techniques 1st edition, Vol., 1996. (b) Best, M. D. Biochemistry, 2009, 48, 6571-6584. (c) Sletten, E. M.;
Bertozzi, C. R. Angew. Chem. Int. Ed, 2009, 48, 6974-6998. (d) Debet, M. F.; van Hest, J. C. M.; Rutjes, P. J. T.
Org. Biomol. Chem., 2013, 6439-6455 (e) Ramil, C. P.; Lin, Q. Chem. Commun, 2013, 49, 11007-11022. (f)
Lang, K.; Chin, J. W. ACS. Chem. Biol, 2014, 9, 16-20. (g) Patterson, D. M.; Nazarova, L. A.; Prescher, J. A.
ACS. Chem. Biol, 2014, 9, 592-605.

39

Chapitre 1

Introduction générale
conduit dans un premier temps à une famille de réactifs à architecture pseudo-peptidique26.
Dans le cadre d’un programme FEDER qui finance mes travaux de thèse (FEDER, programme
« TRIPODE » n° no. 33883), une seconde génération de tripodes dérivé d'un cœur benzénique a
par la suite été envisagée27 afin de faciliter les suivis et les étapes de purification par HPLC semipréparative. Il permet par ailleurs aux trois fonctions réactives d’être relativement dirigées dans
l’espace.

Figure 14: Structure des deux tripodes synthétisés au laboratoire

26, 27

Ceci nous permet d'obtenir une première ébauche de la stratégie envisageable présentée cidessous

26

(a) Clave, G.; Boutal, H.; Hoang, A.; Perraut, F.; Volland, H.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Org. Biomol. Chem.,
2008, 6, 3065-3078. (b) Clave, G.; Boutal, H.; Hoang, A.; Perraut, F.; Volland, H.; Renard, P.-Y.; Romieu, A.
Org. Biomol. Chem., 2009, 7, 5271. (c) Clave, G.; Renard, P.-Y.; Romieu, A.; Volland, H., 2009. (d) Clave, G.;
Renard, P. Y.; Romieu, A.; Volland, H., 2009. (e) Clave, G.; Volland, H.; Flaender, M.; Gasparutto, D.; Romieu,
A.; Renard, P.-Y. Org. Biomol. Chem., 2010, 8, 4329-4345.
27
(a) Viault, G.; Dautrey, S.; Maindron, N.; Hardouin, J.; Renard, P. Y.; Romieu, A. Org. Biomol. Chem, 2013,
11, 2693-2705. (b) travaux non publiés effectués lors des stages post-doctoraux de Sébastien Dautrey (février
2010 - janvier 2012) et de Guillaume Viault (février 2012 - janvier 2013).

40

Chapitre 1

Introduction générale
peptide 1
peptide 1

T

peptide 2

T

B2

Q

ET
FR

FR
ET

B3

Q

B1

peptide 2

Figure 15: Présentation de la stratégie de synthèse envisagée au début de la thèse utilisant la technologie "tripode".

Le second paramètre déterminant pour la réussite de ce projet est l'utilisation d'un "quencheur"
possédant une bande d'absorbance suffisamment large pour recouvrir les spectres d'émission
de deux fluorophores sélectionnés et ainsi satisfaire aux conditions du FRET. Il sera par ailleurs
nécessaire de fonctionnaliser ce "quencheur unviersel" de manière à ce qu'il puisse être utilisé
avec le tripode. Dans le cadre du projet TRIPODE, la synthèse de nouvelles architectures a été
confiée au Dr. Guillaume Viault comme indiqué ci-dessus, la découverte de nouvelles réactions
de bioconjugaison susceptible d’être introduites sur le tripode à Mlle Laurie-Anne Jouanno
(thèse 2011-2014), l’application à la détection de deux activités enzymatiques distinctes m’a été
confiée.

1.2. Positionnement et contexte du projet au sein du laboratoire
Notre laboratoire travaille depuis environ une dizaine d'années au développement d'outils
chimiques innovants, destinés principalement à des applications en imagerie moléculaire
optique mais aussi à la mise au point de tests in vitro/in cellulo de divers (bio)analytes d'intérêt.
En plus des travaux dédiés à la bioconjugaison que nous venons d'évoquer, notre équipe a
beaucoup œuvré dans le développement d'espèces luminescentes tels que des chélates de
lanthanides28

dans

la

synthèse

de

fluorophores

originaux29

ainsi

que

par

leur

hydrosolubilisation30 qu'elle soit directe ou par fonctionnalisation post-synthétique30,31. C'est
28

(a) Poupart, S.; Boudou, C.; Peixoto, P.; Massonneau, M.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Org. Biomol. Chem.,
2006, 4, 4165-4177. (b) Poupart, S.; Boudou, C.; Peixoto, P.; Massonneau, M.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Org.
Biomol. Chem., 2008, 6, 4669. (c) Maindron, N.; Poupart, S.; Hamon, M.; Langlois, J.-B.; Ple, N.; Jean, L.;
Romieu, A.; Renard, P.-Y. Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 2357-2370.
29
(a) Richard, J.-A.; Massonneau, M.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Org. Lett., 2008, 10, 4175-4178. (b) Paunescu,
E.; Louise, L.; Jean, L.; Romieu, A.; Renard, P.-Y. Dyes Pigm., 2011, 91, 427-434.
30
(a) Bouteiller, C.; Clave, G.; Bernardin, A.; Chipon, B.; Massonneau, M.; Renard, P.-Y.; Romieu, A.
Bioconjugate Chem., 2007, 18, 1303-1317. (b) Niu, S. L.; Ulrich, G.; Ziessel, R.; Kiss, A.; Renard, P.-Y.;
Romieu, A. Org. Lett., 2009, 11, 2049-2052. (c) Niu, S. L.; Massif, C.; Ulrich, G.; Ziessel, R.; Renard, P.-Y.;
Romieu, A. Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 66-69. (d) Niu, S.-l.; Massif, C.; Ulrich, G.; Renard, P.-Y.; Romieu,
A.; Ziessel, R. Chem. Eur. J., 2012, 18, 7229-7242. (e) Roubinet, B.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Dyes Pigm.,
2014, 110, 270-284.
31
(a) Chipon, B.; Clave, G.; Bouteiller, C.; Massonneau, M.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Tetrahedron Lett., 2006,
47, 8279-8284. (b) Chipon, B.; Clave, G.; Bouteiller, C.; Massonneau, M.; Renard, P.-Y.; Romieu, A.
Tetrahedron Lett., 2007, 48, 501. (c) Romieu, A.; Brossard, D.; Hamon, M.; Outaabout, H.; Portal, C.; Renard,
P.-Y. Bioconjugate Chem., 2008, 19, 279-289. (d) Romieu, A.; Tavernier-Lohr, D.; Pellet-Rostaing, S.; Lemaire,

41

Introduction générale
ainsi qu'une partie de mes travaux ont été orientés dans ce domaine et seront rapportés dans le
Chapitre 1 afin de fournir les fluorophores destinés à être greffés sur le tripode. En revanche,
avant mon arrivée au laboratoire, la synthèse de "quencheurs" n'avait presque jamais été
étudiée au laboratoire hormis la re-synthèse de quelques réactifs commerciaux. Si le savoirfaire de notre équipe de recherche a permis d'obtenir rapidement des résultats dans la synthèse
de fluorophores (qui seront présentés dans le Chapitre 1), ceci n'a pas été possible pour la
synthèse des "quencheurs" de fluorescence. Une partie importante de ma thèse a donc été
dédiée au développement de méthodes de synthèse efficaces de quencheurs diazoïques ainsi
qu'au développement de structures originales dans le but d'optimiser leurs propriétés physicochimiques (solubilité en milieu aqueux) et photophysiques (gamme de "quenching") ainsi que
leur réactivité en bioconjugaison. L'ensemble des résultats de ces travaux seront présentés dans
le Chapitre 2 de ce manuscrit. Les divers outils chimiques qui ont pu être développés au
laboratoire depuis 2006 ont dans la majorité des cas été valorisés dans le contexte des sondes
fluorogéniques de type FRET, pro-fluorescentes ou chemiluminescentes32. Par analogie, les deux
derniers Chapitres de ce manuscrit seront dédiés à l'utilisation des outils présentés dans les
Chapitres 1 et 2 pour l'élaboration de sondes FRET (Chapitre 3) et pro-fluorescentes (Chapitre
4) avec en point d'orgue l'établissement de stratégies de synthèses hautement convergentes et
facilement modulables pour la préparation de sondes vouées détection simultanées de deux
protéases en milieu biologique.

M.; Renard, P.-Y. Tetrahedron Lett., 2010, 51, 3304-3308. (e) Romieu, A.; Bruckdorfer, T.; Clave, G.;
Grandclaude, V.; Massif, C.; Renard, P.-Y. Org. Biomol. Chem., 2011, 9, 5337-5342. (f) Massif, C.; Dautrey, S.;
Haefele, A.; Ziessel, R.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 4330-4336. (g) Romieu, A.;
Massif, C.; Rihn, S.; Ulrich, G.; Ziessel, R.; Renard, P.-Y. New J. Chem., 2013, 37, 1016-1027.
32
(a) Clave, G.; Bernardin, A.; Massonneau, M.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Tetrahedron Lett., 2006, 47, 62296233. (b) Renard, P. Y.; Romieu, A.; Massonneau, M., 2006. (c) Richard, J.-A.; Jean, L.; Romieu, A.;
Massonneau, M.; Noack-Fraissignes, P.; Renard, P.-Y. Org. Lett., 2007, 9, 4853-4855. (d) Meyer, Y.; Richard,
J.-A.; Massonneau, M.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Org. Lett., 2008, 10, 1517-1520. (e) Renard, P.-Y.; Romieu,
A.; Richard, J.-A.; Massonneau, M., 2008. Renard, P. Y.; Romieu, A.; Richard, J. A.; Massonneau, M., 2008. (f)
Richard, J.-A.; Meyer, Y.; Jolivel, V.; Massonneau, M.; Dumeunier, R.; Vaudry, D.; Vaudry, H.; Renard, P.-Y.;
Romieu, A. Bioconjugate Chem., 2008, 19, 1707-1718. (g) Debunne, M.; Portal, C.; Delest, B.; Brakenhielm, E.;
Lallemand, F.; Henry, J.-P.; Ligeret, H.; Noack, P.; Massonneau, M.; Romieu, A.; Renard, P.-Y.; Thuillez, C.;
Richard, V. Int. J. Mol. Imaging, 2011, 413290, 413213 pp. (h) Koci, J.; Grandclaude, V.; Massonneau, M.;
Richard, J.-A.; Romieu, A.; Renard, P.-Y. Chem. Commun., 2011, 47, 6713-6715. (i) Jolivel, V.; Arthaud, S.;
Botia, B.; Portal, C.; Delest, B.; Clave, G.; Leprince, J.; Romieu, A.; Renard, P.-Y.; Touzani, O.; Ligeret, H.;
Noack, P.; Massonneau, M.; Fournier, A.; Vaudry, H.; Vaudry, D. J. Mol. Neurosci., 2014, Ahead of Print.

42

Chapitre 1

Introduction générale

43

Chapitre 1

Introduction générale

44

Chapitre 1

Synthèse de nouvelles rhodamines non symétriques hydrosolubles

Chapitre 1

Chapitre 1
Synthèse de nouvelles rhodamines non
symétriques hydrosolubles

45

Chapitre 1

Chapitre 1

Synthèse de nouvelles rhodamines non symétriques hydrosolubles

I. Etat de l'Art:
Cette partie consacrée aux travaux connus de la littérature concernant les rhodamines va se
focaliser sur les efforts mis en œuvre pour l'obtention de nouvelles rhodamines possédant des
propriétés physico-chimiques et spectrales optimisées pour des applications biologiques. Leur
utilisation dans le domaine de la pro-fluorescence sera évoquée et sera développée de manière
plus complète dans le Chapitre 4 dédié à des applications de ce type de sondes fluorogéniques.
Les rhodamines sont des fluorophores à cœur xanthène possédant deux anilines substituées (ou
non) sur chacune des extrémités de ce cœur hétérocyclique33. En comparaison d'autres familles
de fluorophores (comme par exemple les cyanines), elles possèdent une quantité d'avantages
que ce soit par leur stabilité chimique et thermique ou pour leurs propriétés optiques
puisqu'elles jouissent à la fois de très bons rendements quantiques et d'une forte résistance au
phénomène photoblanchiement. La Figure 16 présente les différentes formes limites de
résonance de la rhodamine sous sa forme ouverte zwiterionique fluorescente. La lactonisation
intramoléculaire qui est le plus souvent observée en milieu basique conduit à une forme
"fermée" de la rhodamine qui est ainsi non-conjuguée et donc non fluorescente. Le passage de la
forme fermée à la forme ouverte sous l'influence de divers paramètres a largement été mis à
profit pour l'élaboration de sondes pro-fluorescentes34.

Figure 16: Différentes formes limites des rhodamines et propriétés fluorescentes associées

La méthode usuelle pour la synthèse de ces rhodamines consiste en une condensation de deux
équivalents de meta-aminophénols sur un équivalent d'anhydride phtalique comme présenté
Figure 17. Cette réaction est effectuée en milieu acide et nécessite une activation thermique
importante (le plus souvent, un chauffage à une température voisine de 150°C)

33

(a) Beija, M.; Afonso, C. A.; Martinho, J. M. Chem. Soc. Rev, 2009, 38, 2410-2433. (b) Wysocki, L. M.;
Lavis, L. D. Curr. Opin. Chem. Biol., 2011, 15, 752-759.
34
(a) Kim, H. N.; Lee, M. H.; Kim, H. J.; Kim, J. S.; Yoon, J. Chem. Soc. Rev, 2008, 37, 1465-1472. (b) Chen,
X.; Pradhan, T.; Wang, F.; Kim, J. S.; Yoon, J. Chem. Rev., 2012, 112, 1910-1956.

46

Synthèse de nouvelles rhodamines non symétriques hydrosolubles

Chapitre 1

Figure 17: Mécanisme supposé de la formation des rhodamines par réaction d'aminophénols sur l'anhydride phtalique en
conditions acides à haute température.

Cette réaction donne accès facilement aux divers analogues symétriques dont la plupart sont
disponibles commercialement (cf. Introduction Générale). Malgré leurs avantages certains, le
domaine spectral dans lequel ces rhodamines émettent n'est que peu compatible avec des
applications en milieu biologique complexe comme rencontré in vivo. En effet, très peu de
rhodamines possèdent des maxima d'absorption/émission centrés au-delà de 650 nm, et en
fonction de leur caractère hydrophile plus ou moins marqué, leur rendement quantique chute
drastiquement en milieu aqueux via la formation d’exciplexes ou d'agrégats de type H. La
majeure partie des travaux récents concernant la chimie des rhodamines est ainsi axée sur le
développement de nouvelles structures hydrophiles possédant des propriétés optiques
permettant des applications in vivo35. Cette partie du Chapitre 1 de ce manuscrit consacrée à
l'état de l'art sur la synthèse des rhodamines va essentiellement se focaliser sur les structures
développées pour répondre à ces problématiques.

1 Optimisation des propriétés optiques de rhodamines en milieu
biologiques:
1.1. Des rhodamines dans le Proche Infrarouge (NIR).
Deux stratégies principales ont été développées pour déplacer la gamme spectrale des
rhodamines vers le rouge lointain et le NIR. L'extension de la conjugaison du système a été l'une
des premières abordées suivie par une approche fondée sur une modification du cœur xanthène
par substitution de son atome d'oxygène par divers hétéroatomes induisant un effet
bathochrome remarquable. Il est aussi possible d'introduire des modifications sur le phényl en
meso du cœur xanthène, mais cela n'induit le plus souvent qu'un léger déplacement batochrome

35

Sun, Y. Q.; Liu, J.; Lv, X.; Liu, Y.; Zhao, Y.; Guo, W. Angew. Chem. Int. Ed, 2012, 51, 7634-7636.

47

Chapitre 1

Chapitre 1

Synthèse de nouvelles rhodamines non symétriques hydrosolubles

des longueurs d'onde d'absorption et d'émission. L'effet n'étant que peu important, nous
n'évoquerons pas ce sujet dans le reste de cette partie
1.1.1 Modulation des propriétés optiques par modification de la conjugaison du
système.
Tout comme l'extension du pont poly-ène des colorants de type cyanine induit un déplacement
bathochrome de leurs propriétés d'absorption et de fluorescence, l'augmentation de la
conjugaison du système aromatique des rhodamines peut induire un déplacement batochrome
des longueurs d'ondes d'absorption et d'excitation. Le premier exemple a été breveté par la
société Molecular Probes (aujourd'hui propriété de Life Technologies) via les travaux du groupe
de Richard. P. Haugland. En 199936. L'utilisation du phénol 1 a ainsi permis l'obtention de
nouvelles rhodamines avec un système aromatique légèrement plus conjugué via l'existence
d'une double liaison supplémentaire.

Figure 18: Utilisation de l'aminophénol développé par Richard. P. Haugland pour la synthèse de rhodamines à
conjugaison étendue.

La rhodamine formée possède en outre deux substituants méthyle en position pseudobenzylique ce qui leur confère une réactivité particulière, notamment mise à profit pour réaliser
des réactions de sulfonation totalement régio-selective (vide infra). En réalité cet exemple de
rhodamine fait parti d'une famille entière de fluorophores appelé commercialement Alexa Fluor
dans laquelle on retrouve plusieurs types de fluorophores (coumarines, rhodamines, cyanines).
Les propriétés de ces fluorophores sont présentées dans des articles de référence de 199937 et
200338. On y retrouve les structures des dérivés de rhodamines présentées Figure 19.

36

Mao, F.; Leung, W.-Y.; Haugland, R., Molecular Probes(r), 1999, WO99/15517
Panchuk-Voloshina, N.; Haugland, R. P.; Bishop-Stewart, J.; Bhalgat, M. K.; Millard, P. J.; Mao, F.; Leung,
W. Y.; Haugland, R. P. J. Histochem. Cytochem., 1999, 47, 1179-1188.
38
Berlier, J. E.; Rothe, A.; Buller, G.; Bradford, J.; Gray, D. R.; Filanoski, B. J.; Telford, W. G.; Yue, S.; Liu, J.;
Cheung, C. Y.; Chang, W.; Hirsch, J. D.; Beechem Rosaria P. Haugland, J. M.; Haugland, R. P. J. Histochem.
Cytochem., 2003, 51, 1699-1712.
37

48

Synthèse de nouvelles rhodamines non symétriques hydrosolubles
SO3H2N

SO3-

SO3H
O

H
N

NH2+

O

SO3-

Chapitre 1

H+
N

SO3-

H
N

O

CO2-

Cl

SO3- H+
N

CO2H

+

-

3Li

HO2C

O2C

CO2H

H
N

O

Alexa 532
= 530/555 nm
QY = 61% (PBS)

Alexa 488
= 490/519 nm
QY = 92% (PBS)

Abs/Em

Cl

Na+

Cl
Alexa 546
= 556/572 nm
QY = 79% (PBS)

Abs/Em

O

S

Abs/Em

H+
N

N

N+

O

+

H
N
-

CO2H

O3S

SO3-

CO2H

-

O3S

HO2C

SO3-

HO2C

Alexa 568
= 579/603 nm
QY = 69% (PBS)

Alexa 594
= 591/618 nm
QY = 66% (PBS)

Abs/Em

Abs/Em

Figure 19: Structures et propriétés photophysiques des Alexa Fluor de la famille des rhodamines.

Quatre ans plus tard les travaux effectués par le groupe de Kevin Burgess, ont confirmé l'intérêt
d'introduire cette double liaison via la synthèse d’une famille d’analogues de rhodamines
bromées sur l’aromatique en position meso. L’ajout de cette double liaison conjuguée s’est
traduit par un effet batochrome important comme l’illustre la Figure 2039.

39

Figure 20: Analogues bromés des rhodamines développées par le groupe de Kevin Burgess en 2003 .

Un autre exemple développé par Vladimir N. Belov dans le groupe du Professeur Stefan W. Hell a
confirmé cette tendance comme illustré Figure 2140.

39
40

Jiao, G.-S.; Castro, J. C.; Thoresen, l. H.; Burgess, K. Org. Lett., 2003, 5, 3675-3677.
Belov, V. N.; Bossi, M. L.; Folling, J.; Boyarskiy, V. P.; Hell, S. W. Chem. Eur. J., 2009, 15, 10762-10776.

49

Chapitre 1

Chapitre 1

Synthèse de nouvelles rhodamines non symétriques hydrosolubles

40

Figure 21: Comparaison entre deux rhodamines développées par le groupe de Stephan. W. Hell en 2009 .

Ce concept d'introduction de double liaisons supplémentaires a d'ailleurs été ensuite largement
étudié par ce même groupe qui s'est intéressé à la synthèse d'un analogue de julolidine
possédant une double liaison et inspirée des structures développées par le groupe de Richard. P.
Haugland41. Cet aminophénol dont la synthèse est présentée Figure 22 a donné lieu à la synthèse
d'un grand nombre de rhodamines et d'applications en bio-imagerie42.

Figure 22: Synthèse de l'aminophénol x développé par le groupe de Stefan. W. Hell.

A préciser que le phénol 4 bien que commercial peut être rapidement obtenu avec un bon
rendement à partir de la meta-anisidine selon plusieurs méthodes décrites dans la littérature,
notamment en utilisant le triflate d'indium43 dans l'acétone comme cela est présenté Erreur !
Source du renvoi introuvable.
Les derniers travaux en date concernant l'extension de conjugaison de système à cœur xanthène
présentent un équivalent du fusion de deux cœurs xanthènes pour fournir de nouveaux
analogues hyper conjugué appelés "aminobenzopyrano-xanthenes"44.

44

Figure 23: Synthèse des "aminobenzopyrano-xanthenes" développés par Shuichi Enomoto .

41

Hell, S. W.; Belov, V.; Kolmakov, K.; Westphal, V.; Lauterbach, M.; Jakobs, S.; Wurm, C. A.; Eggeling, C.;
Ringemann, C., Max-Planck-Gesellschaft, 2010, EP2253635A1.
42
(a) Kolmakov, K.; Belov, V. N.; Bierwagen, J.; Ringemann, C.; Muller, V.; Eggeling, C.; Hell, S. W. Chem.
Eur. J., 2010, 16, 158-166. (b) Kolmakov, K.; Wurm, C. A.; Hennig, R.; Rapp, E.; Jakobs, S.; Belov, V. N.;
Hell, S. W. Chem. Eur. J., 2012, 18, 12986-12998. Kolmakov, K.; Wurm, C. A.; Meineke, D. N.; Gottfert, F.;
Boyarskiy, V. P.; Belov, V. N.; Hell, S. W. Chem. Eur. J., 2014, 20, 146-157.
43
Pauff, S. M.; Miller, S. C. Org. Lett., 2011, 13, 6196-6199.
44
Kamino, S.; Murakami, M.; Tanioka, M.; Shirasaki, Y.; Watanabe, K.; Horigome, J.; Ooyama, Y.; Enomoto,
S. Org Lett, 2014, 16, 258-261.

50


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