317185460 Memoire de M1 SIMS 2014
Texte de la première page
2013-2014
Master 1
SIMS
Implication de la voie du
TNF-α dans les effets de
microparticules
macrophagiques sur la
contractilité de cellules
cardiaques isolées de
souris adultes
Grimaud Joaquim
Sous la direction du Dr. Noireaud Jacques,
Directeur de Recherche Inserm
Membres du jury
Nom/Prénom 1 | Fonction
Nom/Prénom 2 | Fonction
Nom/Prénom 3 | Fonction
Nom/Prénom 4 | Fonction
Nom/Prénom 5 | Fonction
Nom/Prénom 6 | Fonction
Soutenu le :
19 juin 2014
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REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier en premier lieu le Dr. Jacques Noireaud pour ses nombreux conseils, les
connaissances et expériences qu’il m’a transmis, la confiance qu’il m’a accordée, son accessibilité, sa
disponibilité, sa bonne humeur et sa gentillesse.
Je tiens aussi à remercier le Dr. Ramaroson Andriantsitohaina de m’avoir accueilli au sein de son unité et
sans qui l’occasion de découvrir le monde de la recherche ne m’aurait pas été donnée.
J’adresse également mes remerciements à Badreddine Lahouel et Edward Milbank pour leurs nombreux
conseils et remarques
Je tiens enfin à remercier l’ensemble des membres de l’unité Inserm U1063 pour leur aide et leur
disponibilité tout au long de ces 2 mois de stage.
Sommaire
INTRODUCTION : ........................................................................................................................ 1
1.
2.
3.
4.
5.
Contexte général .................................................................................................................... 1
L’athérosclérose ..................................................................................................................... 1
Les microparticules ................................................................................................................. 2
Le couplage excitation-contraction ........................................................................................ 2
Objectif de l’étude .................................................................................................................. 3
MATERIEL ET METHODES ............................................................................................................ 4
1.
Culture des macrophages RAW 264.7 et obtention des microparticules
macrophagiques .................................................................................................................................... 4
1.1.
Culture cellulaire de la lignée RAW 264.7 ..................................................................................... 4
1.2.
Obtention des microparticules ..................................................................................................... 4
2.
Isolement des cardiomyocytes ............................................................................................... 4
2.1.
Prélèvement des cœurs de souris C57BL/6 adultes ........................................................................ 4
2.2.
Montage Langendorff et digestion enzymatique ............................................................................. 4
3.
Analyse fonctionnelle : Mesure de la contraction et du transitoire calcique des
cardiomyocytes isolés ........................................................................................................................... 5
3.1.
Marquage des cardiomyocytes par la sonde Fura-2AM ................................................................... 5
3.2.
Systèmes d’enregistrement ......................................................................................................... 6
4.
Analyse moléculaire ................................................................................................................ 6
4.1.
Dosage des protéines ................................................................................................................. 6
4.2.
Western-Blot ............................................................................................................................. 6
5.
Analyses statistiques .............................................................................................................. 7
RESULTATS .................................................................................................................................. 7
1.
2.
3.
4.
5.
Le TNFαest présent dans les MPs macrophagiques ................................................................ 7
TNF per se induit un effet inotrope négatif ........................................................................... 7
Le TNF-α n’a pas d’effet sur les transitoires calciques ........................................................... 8
Les MPS induisent un effet inotrope négatif ........................................................................... 9
Le SPD-304 inhibe l’effet des MPs macrophagiques ............................................................... 9
DISCUSSION ............................................................................................................................. 10
CONCLUSION............................................................................................................................. 10
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................................... 11
Liste des abréviations:
Act D : Actinomycine D
Apo B : Apolipoprotéine B
ATP : Adénosine-5’-Triphosphate
BSA : Bovine Serum Albumine (Sérum d’albumine bovine)
Ca2+: Calcium
CICR : Calcium-Induced Calcium Release
DMSO: Diméthyl sulfoxyde
ESM : Erreur standard à la moyenne
HRP : Horseradish peroxydase (Peroxydase de raifort)
I-CAM : Intercellular Adhesion Molecule (Protéine d’adhésion intercellulaire)
ICaL : Canaux calciques potentiel-dépendants de type L (Long Lasting)
IFN-γ: Interféron gamma
IL-1β: Interleukine 1β
IL-8 : Interleukine 8
LDL : Low Density Lipoprotein (Lipoprotéine de basse densité)
M-CSF : Macrophage colony-stimulating Factor
MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein 1 (Protéine chimioattractante pour les monocytes)
MPs : Microparticules
NCX : Echangeur Sodium/Calcium
OMS: Organisation Mondiale de la Santé
oxLDL : Oxidized Low-Density Lipoprotein (Lipoprotéine de basse densité oxydée)
RPE : Résonance Paramagnétique Electronique
RS : Réticulum sarcoplasmique
RYR : Récepteur sensible à la ryanodine
SERCA : Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase
SVF: Sérum de veau foetal
TACE: TNF-α-converting enzyme (Enzyme de conversion du TNF-α)
TBS-Tween : Tris-buffered saline and Tween 20
TNF-α : Tumor necrosis factor alpha (Facteur de nécrose de tumeur alpha)
TNF-R1/2 : Récepteurs au TNF-α de type 1 et 2
V-CAM 1 : Vascular Cell Adhesion Protein 1 (Protéine-1 d’adhésion vasculaire)
RÉSUMÉ
Dans le cas de l’athérosclérose, l’inflammation au niveau des artères coronaires implique l’activation des
monocytes/macrophages et la libération de microparticules (MPs) dans la circulation sanguine, qui
peuvent ainsi venir à proximité des cardiomyocytes myocardique. Par ailleurs, une expression importante
du facteur de nécrose tumoral (TNF)-α par les macrophages de la plaque d’athérome a été mise en
évidence, ce qui rend fortement probable que les MPs issues de ces derniers puissent porter cette
cytokine et activer ainsi les récepteurs TNF de type 1 et 2 portés par les cardiomyocytes. Une étude
préliminaire réalisée dans des cardiomyocytes isolés de souris adulte, a permis de montrer que des MPs
macrophagiques issues de la lignée RAW 264.7, ont pour effet de diminuer et de ralentir le
raccourcissement des sarcomères (effet inotrope négatif), sans affecter les transitoires calciques (i.e. la
libération de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique). L’objectif de cette étude a donc été de déterminer si le
TNF-α est effectivement porté par les MPs et si oui, s’il joue un rôle dans les effets observés des MPs sur
la performance contractile des cardiomyocytes murins adultes. L’approche expérimentale utilisée combine
une méthode d’étude fonctionnelle, i.e. l’analyse concomitante de la contraction des sarcomères et des
transitoires calciques, ainsi qu’une méthode de biologie moléculaire (i.e. western-blot) permettant de
détecter la présence éventuelle de TNF-α dans les MPs. Les résultats obtenus montrent tout d’abord la
présence de TNF-α dans les MPs macrophagiques et que le TNF-α a un effet inotrope négatif sur la
contraction des cardiomyocytes. De plus, l’effet inotrope négatif des MPs macrophagiques sur la
contractilité cardiomyocytaire est supprimé suite à un prétraitement par le SPD-304 (10 M), inhibiteur
spécifique et irréversible des récepteurs au TNF-α. La voie du TNF-α pourrait donc bien être impliquée
dans l’effet des MPs macrophagiques sur la contractilité des cardiomyocytes. Il serait maintenant
intéressant de confirmer l’implication du TNF-α porté par ces MPs en explorant divers voies de
signalisation du TNF-α, comme les voies NO/cGMP/PKG, phospholipase A2/acide arachidonique,
sphingosines.
ABSTRACT
mots-clés : Athérosclérose, macrophage, microparticule, TNF-α, cardiomyocyte, souris adulte
In case of atherosclerosis, inflammation in the coronary arteries involves the activation of monocytes/
macrophages and the release of microparticles (MPs) in the bloodstream. Thus, these MPs can come
close to myocardial cardiomyocytes. Moreover, an important expression of tumor necrosis factor (TNF)-α
by macrophages of atherosclerotic plaque was highlighted, which makes possible that these MPs carry
this cytokine and thus are able to activate the TNF receptors of type 1 and 2 on the cardiomyocytes. A
preliminary study in cardiomyocytes isolated from adult mice, demonstrated that MPs from the
macrophage RAW 264.7 have the effect of reducing and slowing the shortening of sarcomeres (negative
inotropic effect) without affecting calcium transients (i.e. the release of Ca2+ from the sarcoplasmic
reticulum). The objective of this study was to determine whether TNF-α is actually carried by MPs and if
so, if he plays a role in the observed effects of MPs on the contractile performance of adult mouse
cardiomyocytes. The experimental approach combines a method of functional analysis, i.e. the
simultaneous analysis of sarcomeres contraction and calcium transients, and a method of molecular
biology (i.e. Western blot) to detect the presence of TNF-α in the MPs. The results show the presence of
TNF-α in the MPs from the macrophages and that TNF-α has a negative inotropic effect on the contraction
of cardiomyocytes. Moreover, the negative inotropic effect of MPs from macrophages on cardiomyocyte
contractility is removed after a pretreatment with SPD-304 (10 μM), a specific and irreversible inhibitor of
TNF-α receptors. Thus, the TNF-α pathway could be involved in the effect of MPs from macrophages on
contractility of cardiomyocytes. Now, it would be interesting to confirm the involvement of TNF-α carried by
these MPs by studying various signaling pathways of TNF-α, such as NO/ cGMP / PKG, phospholipase
A2/arachidonic acid and sphingosines pathway.
Keywords : Atherosclerosis, microparticle, TNF-α, cardiomyocyte, adult mouse.
Présidence de l'université
40 rue de rennes – BP 73532
49035 Angers cedex
Tél. 02 41 96 23 23 | Fax 02 41 96 23 00
de la paroi artérielle (Lusis, 2000). L’OMS l’a définie
INTRODUCTION :
comme
étant
une
association
variable
de
remaniements de l’intima des artères de moyen et de
1. Contexte général
gros calibre, consistant en une accumulation locale
Depuis ces 40 dernières années, de nombreux
progrès ont été réalisés dans la prévention, le
diagnostic
et
le
traitement
des
maladies
cardiovasculaires (Braunwald et Bristow, 2000).
Toutefois, malgré ces grandes avancées, les
maladies cardiovasculaires continuent de représenter
aujourd’hui une des principales causes de mortalité
dans le monde (World Health Organization, 2007).
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a estimé
que 17 millions de décès en 2008 étaient imputables
aux pathologies cardiovasculaires, soit environ un
tiers de la mortalité mondiale totale (World Health
Organization, 2011). Le diagnostic et la prise en
charge de ces pathologies sont difficiles et ces
dernières ont un impact économique important
(Bloom
et
al.,
épidémiologistes
2011).
indiquent
Les
projections
que
les
des
maladies
cardiovasculaires, notamment d’origine ischémique,
devraient rester l’une des principales causes de
mortalité au moins jusqu’à 2030 (Beaglehole et
de lipides, de glucides complexes, de sang et de
produits sanguins, de tissus fibreux et de dépôts
calcaires. Le tout s’accompagne de modifications de
la média. Cette pathologie a longtemps été
considérée uniquement comme un dépôt passif de
lipides,
mais
aujourd’hui
l’athérosclérose
est
également définie comme une maladie inflammatoire
chronique entraînée par les lipides, en particulier les
LDLs
(« low
density
lipoproteins »)
contenant
l’apolipoprotéine (Apo) B, et les leucocytes (Swirski
et Nahrendorf, 2013). L’athérosclérose peut aussi
toucher des artères de plus petites tailles, comme les
artères coronaires (Libby et al., 2002).
L’accumulation de lipides, et notamment de LDL
oxydés (oxLDL) dans les artères entre l’endothélium
et la lame élastique interne induit une augmentation
de l’expression de certaines molécules d’adhésion
sur la surface endothéliale des vaisseaux, dont la VCAM 1 (« Vascular Cell Adhesion Protein 1 »), l’ICAM
(« Intercellular Adhesion Molecule ») et la P-Sélectine
Bonita, 2008).
(Poston et Johnson-Tidey, 1996). Ces molécules
permettent l’adhésion de
2. L’athérosclérose
circulants
qui
d’ordinaire
monocytes sanguins
ne
se
fixent
pas
(Blankenberg et al., 2003). Ensuite, sous l’effet de
Il s’agit d’une pathologie cardiovasculaire chronique
facteurs chimiotactiques, dont la MCP-1 (« Monocyte
très répandue qui s’amplifie avec l’âge. Elle est sous-
Chemoattractant Protein 1 ») et l’interleukine 8 (IL-8),
jacente à des événements ischémiques coronariens
les monocytes adhérents pénètrent l’intima à travers
(infarctus
et cérébrovasculaires
les jonctions inter-endothéliales. Ces facteurs sont
(accident vasculaire cérébral). Elle est caractérisée
fortement exprimés par les cellules endothéliales de
par le dépôt, dans les artères, d’une plaque
la plaque d’athérome. Les monocytes se différencient
d’athérome essentiellement composée de lipides
ensuite en macrophages sous l’action du M-CSF
riches en cholestérol enveloppée dans une sclérose,
(« Macrophage colony-stimulating factor ») sécrété
i.e. une gaine fibreuse formée par l’épaississement
par les cellules endothéliales. Ces derniers expriment
du
myocarde)
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
1
le récepteur Apo B/E et jouent un rôle « d’éboueurs »
les plus utilisés pour leur étude sont ceux qui sont le
(« scavenger ») en phagocytant les oxLDL accumulés
plus facilement collectables, c'est-à-dire les cellules
dans l’espace sous-endothélial. Les macrophages se
sanguines circulantes telles que les plaquettes, les
chargent donc en cholestérol, ce qui conduit à leur
lymphocytes et les monocytes. La sécrétion de MPs
transformation en cellules dites « spumeuses » qui
est souvent liée à une apoptose déclenchée soit par
s’accumulent. Cette accumulation engendre une
un stress oxydatif important, de grandes forces de
réaction inflammatoire chronique et des lymphocytes
cisaillement « shear stress » ou des lésions.
T sont à leur tour recrutés dans l’intima. Les
Toutefois, la sécrétion de MPs peut aussi être
lymphocytes T libèrent de l’interféron (IFN)-γ et du
déclenchée par une activation de la cellule. C’est par
TNF (« tumor necrosis factor »)-α/β qui stimulent les
exemple le cas des plaquettes et des cellules
cellules spumeuses qui vont à leur tour libérer des
endothéliales (Jenkins et al., 2013). Une fois
cytokines pro-inflammatoires et/ou pro-apoptotiques
libérées, elles pourront soit intéragir avec différents
telles que le TNF-α et l’IL-1β. Ces cytokines
ligands portés par leurs cellules cibles et ainsi activer
renforcent le caractère pro-inflammatoire de la plaque
différentes cascades de signalisation, soit transférer
d’athérome et ont une action autocrine sur les
certains de leurs constituants via des phénomènes
macrophages transformés en cellules spumeuses.
d’internalisation ou de fusion membranaire (Hugel et
Elles les activent et induisent la libération de
al., 2005). Les MPs permettent ainsi à leurs cellules
microparticules (MPs) (Spagnoli et al., 2007).
cibles d’acquérir de nouvelles propriétés et fontions
biologiques. Leur implication a été démontrée dans
de nombreux processus physiopathologiques tels que
3. Les microparticules
la
Les MPs sont dérivées de fragments de membrane
plasmique issue de la cellule qui les sécrète. Leur
thrombose,
l’angiogenèse,
les
le
diabètes,
processus
l’inflammation,
tumoral
et
l’athérosclérose (Freyssinet, 2003 ; Piccin, 2007).
taille varie de 0,1 à 1μm de diamètre. Elles peuvent
se retrouver libérées dans le milieu extracellulaire
apoptotique (Biro et al., 2007; Sewify et al., 2013).
4. Le couplage excitationcontraction
Au
« déchets
Le couplage excitation-contraction cardiaque est un
cellulaires », « platelet dust » (Wolf, 1967), elles sont
processus qui englobe la stimulation électrique des
aujourd’hui
véritables
cardiomyocytes ventriculaires (i.e. du myocarde) et
vecteurs biologiques. En effet, elles portent aussi
ainsi la contraction du cœur permettant d’assurer une
bien des marqueurs membranaires que différents
distribution sanguine dans tout l’organisme. Les
constitutants du cytoplasme ou du noyau (ADN,
cardiomyocytes
ARNm ou miRNA). Les stimuli à l’origine de la
protéines myofibrillaires longitudinales regroupées en
production de microparticules sont multiples et leur
sarcomères, donnant cet aspect strié à la cellule
contenu est très varié (Budaj et al., 2012; Cocucci
cardiaque observée en microscopie optique. Le
et al., 2009; Distler et al., 2005). En théorie, toutes
raccourcissement simultané de ces sarcomères au
les cellules peuvent en produire, mais les modèles
niveau
suite à une activation cellulaire ou à un phénomène
départ
décrites
considérées
comme
comme
des
de
cellulaire
ventriculaires
entraîne
contiennent
le
phénomène
des
de
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
2
contraction myocardique. Le calcium (Ca2+) est le
MPs issues de ces derniers puisse porter cette
messager ubiquitaire essentiel pour cette activité
cytokine (Martinez et al., 2005 ; Tedgui et Mallat,
contractile. La propagation d’un potentiel d’action,
2006). TNF-α est une protéine impliquée dans
initié au niveau sinusal auriculaire cardiaque, le long
l’inflammation systémique et appartient à un groupe
du sarcolemme et du système tubulaire transverse
de cytokines qui stimulent la réaction inflammatoire
des cardiomyocytes induit une entrée de Ca2+ dans le
aiguë. Il existe deux formes de TNF-α, une forme
cardiomyocyte via l’ouverture des canaux calciques
transmembranaire et une forme libre (Horiuchi et al.,
potentiel-dépendants de type L (Long Lasting) (ICaL).
2010). Le TNF-α transmembranaire (26 kDa) est un
Cette entrée d’ions Ca2+ va activer des récepteurs-
précurseur de la forme soluble du TNF-α (17 kDa), on
canaux sensibles à la ryanodine (RYR) qui vont
le retrouve exprimé par les macrophages activés et il
2+
permettre une sortie massive de Ca du RS, i.e. le
transitoire calcique. Cette sortie de Ca
2+
peut-être clivé sous l’action d’une « TNF-α-converting
du RS est
enzyme » (TACE) pour générer la forme soluble du
amplifiée par un rétrocontrôle positif autocatalytique,
TNF-α. Cette forme soluble libre est capable de se
le mécanisme de CICR (« Calcium-induced Calcium
lier aux récepteurs TNF de type 1 et 2 (TNF-R1 et
Release ») (Lee et Keener, 2008). La concentration
TNF-R2) portés par les cardiomyocytes.
calcique passe de 10
l’activation
des
-8
à 10
-6
myofibrilles
M. Le Ca
et
2+
ainsi
induit
le
Une étude préliminaire réalisée dans des
raccourcissement sarcomérique, i.e. la contraction.
cardiomyocytes isolés de souris adulte, a permis de
2+
cytosolique doit ensuite
montrer que des MPs macrophagiques issues de la
diminuer pour permettre la relaxation de l’appareil
lignée RAW 264.7, ont pour effet de diminuer et de
contractile. Le Ca2+ est ainsi principalement (chez la
ralentir le raccourcissement des sarcomères (effet
souris 93%) repompé par la pompe ATPasique
inotrope négatif), sans affecter les transitoires
La concentration de Ca
SERCA
(« Sarco/Endoplasmic
Reticulum
2+
Ca -
calciques (Milbank et al., 2014). L’objectif de cette
ATPase ») du RS, et aussi (7%) expulsé par
étude a donc été de déterminer si le TNF-α est
l’échangeur Sodium/Calcium NCX et la Ca 2+ ATPase
effectivement porté par les MPs et si oui, s’il joue un
du sarcolemme vers le milieu extracellulaire (Bers,
rôle dans les effets observés des MPs sur la
2002).
performance contractile des cardiomyocytes murins
adultes. Un inhibiteur spécifique et irréversible des
5. Objectif de l’étude
Dans le cas de l’athérosclérose, l’inflammation au
récepteurs aux TNF-α, le SPD-304 (10μM ;
Calbiochem) a été utilisé afin de vérifier cette
implication du TNF-α.
niveau des artères coronaires implique l’activation
des monocytes/macrophages et la libération de MPs
dans la circulation sanguine, qui ainsi peuvent venir à
proximité des cardiomyocytes myocardique. Par
ailleurs, une expression importante du TNF-α par les
macrophages de la plaque d’athérome a été mise en
évidence, ce qui rend fortement probable que les
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
3
Matériel et méthodes
produites selon le type de stimulation. Un surnageant
a été obtenu par deux centrifugations de 750 g
1. Culture des macrophages
RAW 264.7 et obtention
des microparticules
macrophagiques
pendant 15 minutes, et de 1500 g pendant 5 minutes
1.1.
deux fois 45 min à 13 000 g. Les MPs contenues
Culture cellulaire de la
lignée RAW 264.7
afin d’éliminer les cellules et les différents débris
cellulaires. Les MPs contenues dans le surnageant
ont été isolées grâce à deux centrifugations
successives pendant 30 minutes à 13 000 g, puis
dans le surnageant ont été récupérées dans du NaCl
RAW 264.7 est une lignée de macrophages obtenue
à 0,9 % et conservées à 4°C jusqu’à leur utilisation.
à partir de souris (Mus Musculus) BALB/c (American
Type Culture Collection, Manasses, VA, USA). Ces
cellules ont été par la suite mises en culture dans un
milieu DMEM (Lonza), additionné de 10% de sérum
de veau fœtal (SVF) décomplémenté, de 1% de
2. Isolement des
cardiomyocytes
2.1.
Pénicilline/Streptomycine, et de 1% de L-gluthamine.
Les cellules ont été placées dans une atmosphère
humidifiée à 5% de CO2 et à 37°C. Le milieu a été
changé toutes les 48 heures, lorsque les cellules
étaient
à
90%
de
confluence
environ.
Les
macrophages RAW 264.7 utilisés dans cette étude
Les
Prélèvement des cœurs
de souris C57BL/6
adultes
souris
utilisées
pour
l’isolement
des
cardiomyocytes ventriculaires sont des mâles de
souche C57BL/6. Elles ont été soumises à un régime
standard et furent utilisées à l’âge de 14 semaines.
pour produire des microparticules l’ont été entre des
repiquages R3 et R10.
1.2.
Obtention des
microparticules
Les cardiomyocytes ventriculaires ont été isolés par
dissociation mécanique comme décrit précédemment
(Pinz et al, 2011). Les souris sont soumises à un
prétraitement par de l’héparine (Héparine Choay,
La lignée cellulaire de macrophages RAW 264.7 a
Sanofi
donc été utilisée pour la production de MPs. Les
intrapéritonéale). L’héparine permet d’éviter toute
cellules ont été réensemencées à une densité de
coagulation sanguine et éventuel infarctus. Après
Aventis,
Paris,
0,05
ml
par
voie
6
2.10 cellules/mL puis mises en culture comme décrit
vingt minutes, les animaux sont sacrifiés dans une
ci-dessus. La production de MPs a été déclenchée
cuve à CO2. Une incision thoracique est ensuite
par traitement durant 24 heures avec soit avec de
réalisée, afin d’exposer le cœur.
l’actinomycine D (ActD, 1μg/mL), soit avec de
l’interleukine-1β (IL-1β ; 10ng/mL) seul, soit du TNF-α
(5ng/mL) seul, soit du TNF-α et de l’IL-1β combinés.
Le traitement le plus efficace pour induire la
production de MPs est l’ActD, qui induit l’apoptose
des macrophages. Quatre types de MPs sont ainsi
2.2.
Montage Langendorff et
digestion enzymatique
Une fois détaché, le cœur est canulé par l’aorte et
placé sur le montage Langendorff. Les artères
coronaires du ventricule gauche sont donc perfusées
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contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
4
de façon rétrograde par une solution tampon HANKS-
concentration calcique du milieu est alors augmentée
HEPES sans Ca2+ ajouté, dite de lavage, à 37°C
durant une phase de réplétion en 4 étapes
(NaCl : 113 mM, KCl : 4,7 mM, KH2PO4: 0,6 mM,
successives de 5 min jusqu’à atteindre 1 mM.
KHCO3 : 10 mM, Na2HPO4 : 0,6 mM, NaHCO3 : 12
mM, HEPES : 10 mM, MgCl2 :1,2 mM, glucose : 5,5
Pour les études par Western-Blot, les cardiomyocytes
mM, taurine : 29 mM, pH ajusté à 7,4 avec du NaOH
sont ensuite déposés dans des boites de Pétri (35
5N) ce qui permet d’enlever toutes traces sanguines
mm de diamètre) prétraitées avec de la laminine (20
dans les artères coronaires. Du 2,3-Butanedione
mg/mL) en présence d’une solution de Tyrode (NaCl :
monoxime (BDM, 10 mM) est ajouté dans cette
113mM, KCl :4,7mM, MgCl2 : 1,2 mM, Na2HPO4 : 0,6
solution de lavage. Il s’agit d’une substance
mM, NaHCO3 : 4,4 mM, HEPES : 20 mM, glucose :
cardioplégique qui d’inhibe l’ATPase de la myosine et
10 mM, taurine : 20 mM, Na pyruvate : 3 mM, CaCl2 :
empêche rapidement et réversiblement la formation
1,25mM, pH : 7,35) pendant 2-3 heures.
des ponts entre actine et myosine. Cela permet au
cœur de rester en permanence relaxé et prévient les
Pour les études fonctionnelles, ce n’est pas la boite
dommages dus aux contractions terminales, à
de Pétri qui est prétraitée avec de la laminine (20
l’ischémie et à la reperfusion (Louch et al, 2011).
mg/mL) mais une lamelle de verre (Corning, 25x25
Toutefois, l’utilisation de ce milieu très réduit en Ca 2+
mm) placée à l’intérieur de la boite de Pétri (35 mm)
entraîne une fragilisation du sarcolemme qui peut
en présence de la même solution de Tyrode pendant
+
induire une accumulation de sodium (Na ). Si bien
que lors de la réintroduction du Ca
2+
2-3 heures.
extracellulaire,
l’échange Na+/Ca2+ est dans le sens d’une entrée de
Ca2+, ce qui va induire une surcharge en Ca 2+
intracellulaire dramatique pour la survie de la cellule.
C’est pourquoi la solution de lavage contient aussi de
la taurine (3 mM) qui permet de protèger les cellules
contre ce phénomène appelé « paradoxe calcique ».
Il existe en effet un symport taurine/Na + permettant
de vider la cellule d’une surcharge de sodium.
3. Analyse fonctionnelle :
Mesure de la contraction
et du transitoire calcique
des cardiomyocytes
isolés
3.1.
Ensuite, une solution de lavage contenant de la
Marquage des
cardiomyocytes par la
sonde Fura-2AM
Liberase (Solution commerciale contenant différents
types de collagénases ; Roche, 10 ml/mL) est
Les cardiomyocytes sont chargés ou non avec du
perfusée jusqu’à ce qu’une augmentation du débit
Fura-2AM
d’écoulement soit observée (6-9 min), ce qui
Molecular Probes, 1μM dans du DMSO [diméthyl
témoigne d’une bonne digestion des connections
sulfoxide]) à température ambiante et obscurité
intercellulaires. Une fois digéré, le cœur est détaché
pendant 20 minutes, puis lavés durant 5 minutes
par coupure au niveau des oreillettes. Puis, les
avec la solution de Tyrode afin de permettre la
cellules sont dissociées par séparation mécanique,
(ester
acétoxyméthylé
perméant,
désestérification du Fura-2 intracellulaire.
filtrées et mises à sédimenter pendant 10 minutes. La
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
5
3.2.
Systèmes
d’enregistrement
en duplicate sur une plaque 96 puits. 25 μL de réactif
A (BioRad), contenant des ions Cu2+, sont ensuite
Les raccourcissements des sarcomères et les
transitoires
calciques
ont
été
enregistrés
simultanément en imposant une stimulation électrique
de champ (0,5 Hz, 0,1 ms, 7-15 V) à l’aide du
système IonOptix (Myocyte Calcium and Contractility
Recording System, Dublin, Irlande) couplé à un
microscope à fluorescence inversée (Episcopic
fluorescence
attachment
ef-inv-II ;
Inverted
microscope AE30-31). La contraction des sarcomères
est enregistrée à une fréquence de 500 Hz tandis que
les transitoires calciques sont enregistrés à une
fréquence de 250 Hz. Les réponses sont analysées
avec le logiciel IonWizard 6.3 (IonOptix).
ajoutés. Les atomes d’azote contenus dans les
liaisons peptidiques des protéines réduisent ces ions
Cu2+ en ions Cu+. Puis, 200 μL d’un réactif B
(BioRad) sont ajoutés. Ce dernier va former un
complexe de couleur bleu avec les ions Cu+. La
plaque est laissée à incuber 10 minutes à l’abri de la
lumière puis l’absorbance est mesurée à 570 nm
grâce à un lecteur de microplaques (Mithras LB 940,
Berthold technologies). La détermination de la
concentration
se
fait
par
comparaison
avec
l’absorbance mesurée d’une gamme étalon de BSA
(« Bovine serum albumine ») 5%.
4.2.
Western-Blot
Les protéines sont séparées sur un gel de poly-
4. Analyse moléculaire
Suite aux différentes stimulations, les cardiomyocytes
sont détachés par grattage, puis les protéines en sont
extraites. Pour cela, les cellules sont récupérées
dans des tubes eppendorf et centrifugés à 500g
pendant 5 minutes à 20°C. Le culot est repris dans du
PBS, puis centrifugé à 1500g pendant 5 minutes. Le
surnageant est ensuite éliminé et le culot plongé dans
l’azote liquide. Dans un premier temps, le dosage des
protéines est réalisé selon la méthode de Lowry. Ce
dosage permet d’orienter la manière dont il est
possible d’exploiter l’échantillon par la suite et
notamment de savoir si la quantité de protéines est
suffisante pour une détection par Western-Blot. Le
reste de l’échantillon est ensuite utilisé pour réaliser
des Western-Blot.
4.1.
Dosage des protéines
acrylamide (Novex Protein from Life technologies,
NuPAGE 4-12% Bis-Tri Gel ; 1,0 mm X 12 well ou 1,5
mm X 10 well) pendant 90 minutes à 150 V, puis
transférées sur une membrane de nitrocellulose
pendant 90 minutes à 110 V à 4°C. La membrane est
alors colorée au rouge Ponceau puis saturée avec
une solution de sérum d’albumine bovine (BSA) à 5%
pendant 90 minutes à température ambiante afin
d’éliminer les sites de fixation non spécifiques.
Ensuite, la membrane est mise à incuber avec
l’anticorps
primaire
pendant
90
minutes
à
température ambiante, ou à 4°C durant la nuit. Le
lendemain, 3 lavages de 10 minutes au TBS-Tween
(Tris buffered saline and Tween) (20 mM Tris ;
61,5mM NaCl ; 0,1% Tween) sont effectués afin
d’éliminer
l’anticorps
en
excès.
L’anticorps
secondaire couplé à la peroxydase est alors mis à
incuber avec la membrane pendant 90 minutes à
température ambiante, puis une autre série de
Le dosage des protéines a été réalisé en suivant le
protocole de Lowry. 5 μL d’échantillons sont déposés
lavages, 3 fois 10 minutes, avec du TBS-Tween est
effectuée.
Les
protéines
sont
révélées
par
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
6
chemiluminescence soit avec du luminol (Santa Cruz)
Résultats
pendant 1 minute, soit grâce au kit de révélation
SuperSignal® West Femto Maximum Sensitivity
Substrate (ThermoScientific, Fischer) pendant 3
minutes. La révélation s’effectue grâce à un système
1. Le TNFαest présent dans
les MPs macrophagiques
d’acquisition en chambre noire (ChemiSmart 500,
Le TNF-α a été détecté par Western-blot sur des
Vilbert Lourmat) et du logiciel Chemi-Capt 5.0. Les
extraits protéiques de MPs issues de macrophages
différents anticorps qui ont été utilisés sont l’anticorps
RAW 264.7 traitées avec de l’ActD (figure 1). Sur les
polyclonal anti-TNF-α (Santa Cruz, 1/500) produit
membranes de nitrocellulose, on peut notamment
chez la chèvre, l’anticorps polyclonal anti-α-tubuline
distinguer les bandes correspondant aux deux formes
(Santa Cruz, 1/500) produit chez la chèvre et l’anti-
de TNF-α, libre (17kDa) et transmembranaire
IgG de chèvre conjugué à HRP (Santa Cruz, 1/5000)
(26kDa).
produit chez l’âne.
5. Analyses statistiques
Les différentes bandes d’intérêt des Western Blot
sont quantifiées relativement à l’aide du logiciel BIO1D. Ces résultats sont exprimés en moyenne ± erreur
Figure 1 : Western-blot montrant la présence de
standard à la moyenne (ESM) de “n” expériences, i.e.
TNF-α dans les MPs
le nombre de souris étudiées. Les différences entre
Expression du TNF-α (n=3)
les groupes de données ont été comparées à l’aide
d’un Mann-Whitney non paramétrique à l’aide du
logiciel Prism 5.0. Une valeur de P inférieur à 0,05 a
été admise pour que les différences entre les
données soient considérées comme significatives.
Les résultats des analyes fonctionnelles sont
exprimés en moyenne ± ESM de « n » expériences,
i.e. le nombre de cellules étudiées. Les différences
entre les groupes de données ont été comparées sur
le logiciel Prism 5.0 à l’aide du test t (test de Student)
2. TNF per se induit un
effet inotrope négatif
L’étude de l’effet du TNF-α per se (800 U/mL) sur la
contractilité des cardiomyocytes (figure 2) indique
que le TNF-α a un effet inotrope négatif sur les
cardiomyocytes
dès
15
min
et
induit
un
ralentissement des cinétiques de raccourcissement et
de relaxation sarcomérique.
non apparié et par la méthode statistique ANOVA,
suivie d’un test de comparaisons multiples de
Bonferroni, pour les expériences utilisant les MPs.
Une valeur de P inférieure à 0,05 a été admise pour
que les différences entre les données soient
considérées comme significatives.
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
7
3. Le TNF-α n’a pas d’effet
sur les transitoires
calciques
L’étude de l’effet du TNF-α (800 U/mL) sur les
transitoires calciques des cardiomyocytes (figure 3)
indique qu’il n’y a pas d’effets significatifs du TNF-α
sur les différents paramètres du transitoire calcique.
Figure 2: Effet du TNF-α per se (800 U/mL) sur la
contractilité des cardiomyocytes
A : Amplitude maximale de raccourcissement (% de
variation de la longueur basale de sarcomère)
B : Vitesse maximale de raccourcissement (-dL/dt, en
μm/sec)
C : Vitesse maximale de réallongement (+dL/dt, en
μm/sec)
Les valeurs représentent les moyennes ± ESM; n=2428 cellules par groupe, *P<0.05 vs. Contrôle (CTRL).
Figure 3: Effets contrôles du TNF-α (800 U/mL)
sur les transitoires calciques des cardiomyocytes
A : Pourcentage de variation du rapport de
fluorescence F340/F380
B : Vitesse maximale de sortie de Ca2+ à l’extérieur
du RS (depV)
C : Temps au pic depuis t0 (milliseconde) (peak T)
D : Vitesse maximale de repompage du Ca 2+ (retV)
E : Constante de tps de repompage calcique (en
milliseconde) (TAU)
Les valeurs représentent les moyennes ± ESM; n=2428 cellules par groupe, *P<0.05 vs. Contrôle (CTRL).
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
8
4. Les MPS induisent un
effet inotrope négatif
5. Le SPD-304 inhibe l’effet
des MPs macrophagiques
L’étude de l’effet des MPs sur la contractilité des
L’étude de l’effet du SPD-304 (10 μM) sur l’effet
cardiomyocytes (figure 4) indique que les MPs ont un
inotrope négatif des MPs (figure 5) indique que Le
effet inotrope négatif rapide sur les cardiomyocytes
SPD-30 empêche l’effet inotrope négatif des MPs.
car
ils
induisent
une
diminution
des
raccourcissements sarcomériques.
Figure 4 : Effet des MPs à 1 et 10 μg/ml sur la
contractilité des cardiomyocytes
A : Enregistrement typique des raccourcissements
sarcomérique
B : Enregistrement typique des transitoires calciques
C : histogramme présentant l’effet des MPs à 1 et 10
μg/ml sur le pourcentage de raccourcissement
sarcomérique.
Les
valeurs
représentent
les
Figure 5: Effet du SPD-304 (10 μM) sur l’effet
moyennes ± ESM; n=28-50 cellules par groupe,
*P<0,05 vs. contrôle (CTRL).
inotrope négatif des MPs
A:
Pourcentages
des
raccourcissements
sarcomériques des cardiomyocytes étudiés par
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
9
vidéo-imaging en présence ou non de MPs et de
d’expression de protéines impliquées dans le
SPD-304
couplage excitation-contraction.
B : Vitesse maximale de contraction sarcomérique
(depV, μm/sec)
Les
C : Vitesse maximale de relaxation sarcomérique
transmembranaire est porté par les MPs issues des
(retV, μm/sec)
macrophages RAW 264.7 traités avec de l’Act D. De
Les valeurs représentent les moyennes ± ESM; n=16-
plus, il a été montré que le TNF-α transmembranaire
50 cellules par groupe, *P<0,05 vs. contrôle (CTRL).
est capable d’intéragir avec le TNF-R1 et le TNF-R2
résultats
indiquent
que
le
TNF-α
(Horiuchi et al., 2010). Ces récepteurs TNF-R1 et
TNF-R2 se retrouvent exprimés à la surface des
Discussion
cardiomyocytes (Higuchi et al., 2004).
Lors de cette étude, la présence de TNF-α a bien été
confirmée dans les MPs. De plus le TNF-α a un effet
Il n’y a pas eu d’effet observé des MPs sur le
inotrope négatif sur la contraction, i.e. provoque une
transitoire calcique. Il est néanmoins possible qu’il y
diminution de la contractilité des cardiomyocytes.
Cependant, cette diminution de la contractilité ne
s’accompagne pas d’une modification des transitoires
ait un effet et que cet effet ne soit pas détectable
avec la technique utilisée ou que la libération de Ca 2+
à partir du RS cache la diminution éventuelle de
calciques. Nous avons confirmé que les MPs
l’entrée de Ca2+ par ICaL. Cependant, d’autres
induisent un effet inotrope négatif. L’inhibition de la
travaux indiquent que le TNF-α aurait plutôt un effet
voie du TNF-α par son inhibiteur SPD-304 rétablie la
sur la sensibilité des protéines contractiles au Ca 2+
contractilité normale. L’ensemble de ces résultats
(Goldhaber et al., 1996). En présence de TNF-α, la
suggère que le TNF-α est impliqué dans l’effet
sensibilité des protéines contractiles, comme l’actine,
inotrope négatif des MPs issues de macrophages sur
la myosine ou la troponine I au Ca2+ serait diminuée.
la contractilité des cardiomyocytes.
Il existe un autre mécanisme d’intéraction potentiel
Conclusion
entre MPs et cardiomyocytes différent de l’intéraction
La voie du TNF-α pourrait donc bien être impliquée
l’internalisation.
processus
dans l’effet des MPs macrophagiques sur la
d’internalisation des MPs sur des cardiomyocytes a
contractilité des cardiomyocytes. Il serait maintenant
déjà été étudié (Milbank et al., 2014). Il a ainsi été
intéressant de confirmer l’implication du TNF-α porté
montré que les MPs commencent à être internalisées
par ces MPs en explorant diverses voies de
ligand-récepteur,
seulement
après
1
heure
au
Ce
contact
d’un
signalisation
du
TNF-α,
comme
la
voie
du
cardiomyocyte, tandis que l’effet inotrope négatif des
NO/cGMP/PKG, la voie phospholipase A2/acide
MPs est observé seulement après 5 minutes.
arachidonique et la voie sphingosines. Différents
L’implication de ce mode d’action est donc écartée.
inhibiteurs pharmacologiques pourraient être utilisés
Le temps de traitement avec les MPs est également
comme la L-Nitroarginine (LNA) qui est un inhibiteur
trop
de la « nitric oxide synthase » (NOS), l’ODQ (1H-
court
pour
entraîner
des
modifications
[1,2,4]oxadiazolo-[4, 3-a]quinoxalin-1-one) qui est un
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
10
inhibiteur de la guanylate cyclase soluble (GCs), le
-
KT 5823 qui est un inhibiteur de la protéine kinase G
(PKG),
l’AACOCF3
(Arachidonyl
Shedding microvesicles: artefacts no more.
trifluoromethyl
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12
ENGAGEMENT
DE NON PLAGIAT
Je, soussigné(e) ......................................................................
déclare être pleinement conscient(e) que le plagiat de documents ou d’une
partie d’un document publiée sur toutes formes de support, y compris l’internet,
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En conséquence, je m’engage à citer toutes les sources que j’ai utilisées
pour écrire ce rapport ou mémoire.
signé par l'étudiant(e) le 31 / 05 / 2014
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49035 Angers cedex
Tél. 02 41 96 23 23 | Fax 02 41 96 23 00
Master 1
SIMS
Implication de la voie du
TNF-α dans les effets de
microparticules
macrophagiques sur la
contractilité de cellules
cardiaques isolées de
souris adultes
Grimaud Joaquim
Sous la direction du Dr. Noireaud Jacques,
Directeur de Recherche Inserm
Membres du jury
Nom/Prénom 1 | Fonction
Nom/Prénom 2 | Fonction
Nom/Prénom 3 | Fonction
Nom/Prénom 4 | Fonction
Nom/Prénom 5 | Fonction
Nom/Prénom 6 | Fonction
Soutenu le :
19 juin 2014
L’auteur du présent document vous
autorise à le partager, reproduire,
distribuer et communiquer selon
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manière qui suggérerait qu’il approuve votre utilisation de l’œuvre).
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Ces conditions d’utilisation (attribution, pas d’utilisation
commerciale, pas de modification) sont symbolisées par
les icônes positionnées en pied de page.
REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier en premier lieu le Dr. Jacques Noireaud pour ses nombreux conseils, les
connaissances et expériences qu’il m’a transmis, la confiance qu’il m’a accordée, son accessibilité, sa
disponibilité, sa bonne humeur et sa gentillesse.
Je tiens aussi à remercier le Dr. Ramaroson Andriantsitohaina de m’avoir accueilli au sein de son unité et
sans qui l’occasion de découvrir le monde de la recherche ne m’aurait pas été donnée.
J’adresse également mes remerciements à Badreddine Lahouel et Edward Milbank pour leurs nombreux
conseils et remarques
Je tiens enfin à remercier l’ensemble des membres de l’unité Inserm U1063 pour leur aide et leur
disponibilité tout au long de ces 2 mois de stage.
Sommaire
INTRODUCTION : ........................................................................................................................ 1
1.
2.
3.
4.
5.
Contexte général .................................................................................................................... 1
L’athérosclérose ..................................................................................................................... 1
Les microparticules ................................................................................................................. 2
Le couplage excitation-contraction ........................................................................................ 2
Objectif de l’étude .................................................................................................................. 3
MATERIEL ET METHODES ............................................................................................................ 4
1.
Culture des macrophages RAW 264.7 et obtention des microparticules
macrophagiques .................................................................................................................................... 4
1.1.
Culture cellulaire de la lignée RAW 264.7 ..................................................................................... 4
1.2.
Obtention des microparticules ..................................................................................................... 4
2.
Isolement des cardiomyocytes ............................................................................................... 4
2.1.
Prélèvement des cœurs de souris C57BL/6 adultes ........................................................................ 4
2.2.
Montage Langendorff et digestion enzymatique ............................................................................. 4
3.
Analyse fonctionnelle : Mesure de la contraction et du transitoire calcique des
cardiomyocytes isolés ........................................................................................................................... 5
3.1.
Marquage des cardiomyocytes par la sonde Fura-2AM ................................................................... 5
3.2.
Systèmes d’enregistrement ......................................................................................................... 6
4.
Analyse moléculaire ................................................................................................................ 6
4.1.
Dosage des protéines ................................................................................................................. 6
4.2.
Western-Blot ............................................................................................................................. 6
5.
Analyses statistiques .............................................................................................................. 7
RESULTATS .................................................................................................................................. 7
1.
2.
3.
4.
5.
Le TNFαest présent dans les MPs macrophagiques ................................................................ 7
TNF per se induit un effet inotrope négatif ........................................................................... 7
Le TNF-α n’a pas d’effet sur les transitoires calciques ........................................................... 8
Les MPS induisent un effet inotrope négatif ........................................................................... 9
Le SPD-304 inhibe l’effet des MPs macrophagiques ............................................................... 9
DISCUSSION ............................................................................................................................. 10
CONCLUSION............................................................................................................................. 10
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................................... 11
Liste des abréviations:
Act D : Actinomycine D
Apo B : Apolipoprotéine B
ATP : Adénosine-5’-Triphosphate
BSA : Bovine Serum Albumine (Sérum d’albumine bovine)
Ca2+: Calcium
CICR : Calcium-Induced Calcium Release
DMSO: Diméthyl sulfoxyde
ESM : Erreur standard à la moyenne
HRP : Horseradish peroxydase (Peroxydase de raifort)
I-CAM : Intercellular Adhesion Molecule (Protéine d’adhésion intercellulaire)
ICaL : Canaux calciques potentiel-dépendants de type L (Long Lasting)
IFN-γ: Interféron gamma
IL-1β: Interleukine 1β
IL-8 : Interleukine 8
LDL : Low Density Lipoprotein (Lipoprotéine de basse densité)
M-CSF : Macrophage colony-stimulating Factor
MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein 1 (Protéine chimioattractante pour les monocytes)
MPs : Microparticules
NCX : Echangeur Sodium/Calcium
OMS: Organisation Mondiale de la Santé
oxLDL : Oxidized Low-Density Lipoprotein (Lipoprotéine de basse densité oxydée)
RPE : Résonance Paramagnétique Electronique
RS : Réticulum sarcoplasmique
RYR : Récepteur sensible à la ryanodine
SERCA : Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase
SVF: Sérum de veau foetal
TACE: TNF-α-converting enzyme (Enzyme de conversion du TNF-α)
TBS-Tween : Tris-buffered saline and Tween 20
TNF-α : Tumor necrosis factor alpha (Facteur de nécrose de tumeur alpha)
TNF-R1/2 : Récepteurs au TNF-α de type 1 et 2
V-CAM 1 : Vascular Cell Adhesion Protein 1 (Protéine-1 d’adhésion vasculaire)
RÉSUMÉ
Dans le cas de l’athérosclérose, l’inflammation au niveau des artères coronaires implique l’activation des
monocytes/macrophages et la libération de microparticules (MPs) dans la circulation sanguine, qui
peuvent ainsi venir à proximité des cardiomyocytes myocardique. Par ailleurs, une expression importante
du facteur de nécrose tumoral (TNF)-α par les macrophages de la plaque d’athérome a été mise en
évidence, ce qui rend fortement probable que les MPs issues de ces derniers puissent porter cette
cytokine et activer ainsi les récepteurs TNF de type 1 et 2 portés par les cardiomyocytes. Une étude
préliminaire réalisée dans des cardiomyocytes isolés de souris adulte, a permis de montrer que des MPs
macrophagiques issues de la lignée RAW 264.7, ont pour effet de diminuer et de ralentir le
raccourcissement des sarcomères (effet inotrope négatif), sans affecter les transitoires calciques (i.e. la
libération de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique). L’objectif de cette étude a donc été de déterminer si le
TNF-α est effectivement porté par les MPs et si oui, s’il joue un rôle dans les effets observés des MPs sur
la performance contractile des cardiomyocytes murins adultes. L’approche expérimentale utilisée combine
une méthode d’étude fonctionnelle, i.e. l’analyse concomitante de la contraction des sarcomères et des
transitoires calciques, ainsi qu’une méthode de biologie moléculaire (i.e. western-blot) permettant de
détecter la présence éventuelle de TNF-α dans les MPs. Les résultats obtenus montrent tout d’abord la
présence de TNF-α dans les MPs macrophagiques et que le TNF-α a un effet inotrope négatif sur la
contraction des cardiomyocytes. De plus, l’effet inotrope négatif des MPs macrophagiques sur la
contractilité cardiomyocytaire est supprimé suite à un prétraitement par le SPD-304 (10 M), inhibiteur
spécifique et irréversible des récepteurs au TNF-α. La voie du TNF-α pourrait donc bien être impliquée
dans l’effet des MPs macrophagiques sur la contractilité des cardiomyocytes. Il serait maintenant
intéressant de confirmer l’implication du TNF-α porté par ces MPs en explorant divers voies de
signalisation du TNF-α, comme les voies NO/cGMP/PKG, phospholipase A2/acide arachidonique,
sphingosines.
ABSTRACT
mots-clés : Athérosclérose, macrophage, microparticule, TNF-α, cardiomyocyte, souris adulte
In case of atherosclerosis, inflammation in the coronary arteries involves the activation of monocytes/
macrophages and the release of microparticles (MPs) in the bloodstream. Thus, these MPs can come
close to myocardial cardiomyocytes. Moreover, an important expression of tumor necrosis factor (TNF)-α
by macrophages of atherosclerotic plaque was highlighted, which makes possible that these MPs carry
this cytokine and thus are able to activate the TNF receptors of type 1 and 2 on the cardiomyocytes. A
preliminary study in cardiomyocytes isolated from adult mice, demonstrated that MPs from the
macrophage RAW 264.7 have the effect of reducing and slowing the shortening of sarcomeres (negative
inotropic effect) without affecting calcium transients (i.e. the release of Ca2+ from the sarcoplasmic
reticulum). The objective of this study was to determine whether TNF-α is actually carried by MPs and if
so, if he plays a role in the observed effects of MPs on the contractile performance of adult mouse
cardiomyocytes. The experimental approach combines a method of functional analysis, i.e. the
simultaneous analysis of sarcomeres contraction and calcium transients, and a method of molecular
biology (i.e. Western blot) to detect the presence of TNF-α in the MPs. The results show the presence of
TNF-α in the MPs from the macrophages and that TNF-α has a negative inotropic effect on the contraction
of cardiomyocytes. Moreover, the negative inotropic effect of MPs from macrophages on cardiomyocyte
contractility is removed after a pretreatment with SPD-304 (10 μM), a specific and irreversible inhibitor of
TNF-α receptors. Thus, the TNF-α pathway could be involved in the effect of MPs from macrophages on
contractility of cardiomyocytes. Now, it would be interesting to confirm the involvement of TNF-α carried by
these MPs by studying various signaling pathways of TNF-α, such as NO/ cGMP / PKG, phospholipase
A2/arachidonic acid and sphingosines pathway.
Keywords : Atherosclerosis, microparticle, TNF-α, cardiomyocyte, adult mouse.
Présidence de l'université
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49035 Angers cedex
Tél. 02 41 96 23 23 | Fax 02 41 96 23 00
de la paroi artérielle (Lusis, 2000). L’OMS l’a définie
INTRODUCTION :
comme
étant
une
association
variable
de
remaniements de l’intima des artères de moyen et de
1. Contexte général
gros calibre, consistant en une accumulation locale
Depuis ces 40 dernières années, de nombreux
progrès ont été réalisés dans la prévention, le
diagnostic
et
le
traitement
des
maladies
cardiovasculaires (Braunwald et Bristow, 2000).
Toutefois, malgré ces grandes avancées, les
maladies cardiovasculaires continuent de représenter
aujourd’hui une des principales causes de mortalité
dans le monde (World Health Organization, 2007).
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a estimé
que 17 millions de décès en 2008 étaient imputables
aux pathologies cardiovasculaires, soit environ un
tiers de la mortalité mondiale totale (World Health
Organization, 2011). Le diagnostic et la prise en
charge de ces pathologies sont difficiles et ces
dernières ont un impact économique important
(Bloom
et
al.,
épidémiologistes
2011).
indiquent
Les
projections
que
les
des
maladies
cardiovasculaires, notamment d’origine ischémique,
devraient rester l’une des principales causes de
mortalité au moins jusqu’à 2030 (Beaglehole et
de lipides, de glucides complexes, de sang et de
produits sanguins, de tissus fibreux et de dépôts
calcaires. Le tout s’accompagne de modifications de
la média. Cette pathologie a longtemps été
considérée uniquement comme un dépôt passif de
lipides,
mais
aujourd’hui
l’athérosclérose
est
également définie comme une maladie inflammatoire
chronique entraînée par les lipides, en particulier les
LDLs
(« low
density
lipoproteins »)
contenant
l’apolipoprotéine (Apo) B, et les leucocytes (Swirski
et Nahrendorf, 2013). L’athérosclérose peut aussi
toucher des artères de plus petites tailles, comme les
artères coronaires (Libby et al., 2002).
L’accumulation de lipides, et notamment de LDL
oxydés (oxLDL) dans les artères entre l’endothélium
et la lame élastique interne induit une augmentation
de l’expression de certaines molécules d’adhésion
sur la surface endothéliale des vaisseaux, dont la VCAM 1 (« Vascular Cell Adhesion Protein 1 »), l’ICAM
(« Intercellular Adhesion Molecule ») et la P-Sélectine
Bonita, 2008).
(Poston et Johnson-Tidey, 1996). Ces molécules
permettent l’adhésion de
2. L’athérosclérose
circulants
qui
d’ordinaire
monocytes sanguins
ne
se
fixent
pas
(Blankenberg et al., 2003). Ensuite, sous l’effet de
Il s’agit d’une pathologie cardiovasculaire chronique
facteurs chimiotactiques, dont la MCP-1 (« Monocyte
très répandue qui s’amplifie avec l’âge. Elle est sous-
Chemoattractant Protein 1 ») et l’interleukine 8 (IL-8),
jacente à des événements ischémiques coronariens
les monocytes adhérents pénètrent l’intima à travers
(infarctus
et cérébrovasculaires
les jonctions inter-endothéliales. Ces facteurs sont
(accident vasculaire cérébral). Elle est caractérisée
fortement exprimés par les cellules endothéliales de
par le dépôt, dans les artères, d’une plaque
la plaque d’athérome. Les monocytes se différencient
d’athérome essentiellement composée de lipides
ensuite en macrophages sous l’action du M-CSF
riches en cholestérol enveloppée dans une sclérose,
(« Macrophage colony-stimulating factor ») sécrété
i.e. une gaine fibreuse formée par l’épaississement
par les cellules endothéliales. Ces derniers expriment
du
myocarde)
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
1
le récepteur Apo B/E et jouent un rôle « d’éboueurs »
les plus utilisés pour leur étude sont ceux qui sont le
(« scavenger ») en phagocytant les oxLDL accumulés
plus facilement collectables, c'est-à-dire les cellules
dans l’espace sous-endothélial. Les macrophages se
sanguines circulantes telles que les plaquettes, les
chargent donc en cholestérol, ce qui conduit à leur
lymphocytes et les monocytes. La sécrétion de MPs
transformation en cellules dites « spumeuses » qui
est souvent liée à une apoptose déclenchée soit par
s’accumulent. Cette accumulation engendre une
un stress oxydatif important, de grandes forces de
réaction inflammatoire chronique et des lymphocytes
cisaillement « shear stress » ou des lésions.
T sont à leur tour recrutés dans l’intima. Les
Toutefois, la sécrétion de MPs peut aussi être
lymphocytes T libèrent de l’interféron (IFN)-γ et du
déclenchée par une activation de la cellule. C’est par
TNF (« tumor necrosis factor »)-α/β qui stimulent les
exemple le cas des plaquettes et des cellules
cellules spumeuses qui vont à leur tour libérer des
endothéliales (Jenkins et al., 2013). Une fois
cytokines pro-inflammatoires et/ou pro-apoptotiques
libérées, elles pourront soit intéragir avec différents
telles que le TNF-α et l’IL-1β. Ces cytokines
ligands portés par leurs cellules cibles et ainsi activer
renforcent le caractère pro-inflammatoire de la plaque
différentes cascades de signalisation, soit transférer
d’athérome et ont une action autocrine sur les
certains de leurs constituants via des phénomènes
macrophages transformés en cellules spumeuses.
d’internalisation ou de fusion membranaire (Hugel et
Elles les activent et induisent la libération de
al., 2005). Les MPs permettent ainsi à leurs cellules
microparticules (MPs) (Spagnoli et al., 2007).
cibles d’acquérir de nouvelles propriétés et fontions
biologiques. Leur implication a été démontrée dans
de nombreux processus physiopathologiques tels que
3. Les microparticules
la
Les MPs sont dérivées de fragments de membrane
plasmique issue de la cellule qui les sécrète. Leur
thrombose,
l’angiogenèse,
les
le
diabètes,
processus
l’inflammation,
tumoral
et
l’athérosclérose (Freyssinet, 2003 ; Piccin, 2007).
taille varie de 0,1 à 1μm de diamètre. Elles peuvent
se retrouver libérées dans le milieu extracellulaire
apoptotique (Biro et al., 2007; Sewify et al., 2013).
4. Le couplage excitationcontraction
Au
« déchets
Le couplage excitation-contraction cardiaque est un
cellulaires », « platelet dust » (Wolf, 1967), elles sont
processus qui englobe la stimulation électrique des
aujourd’hui
véritables
cardiomyocytes ventriculaires (i.e. du myocarde) et
vecteurs biologiques. En effet, elles portent aussi
ainsi la contraction du cœur permettant d’assurer une
bien des marqueurs membranaires que différents
distribution sanguine dans tout l’organisme. Les
constitutants du cytoplasme ou du noyau (ADN,
cardiomyocytes
ARNm ou miRNA). Les stimuli à l’origine de la
protéines myofibrillaires longitudinales regroupées en
production de microparticules sont multiples et leur
sarcomères, donnant cet aspect strié à la cellule
contenu est très varié (Budaj et al., 2012; Cocucci
cardiaque observée en microscopie optique. Le
et al., 2009; Distler et al., 2005). En théorie, toutes
raccourcissement simultané de ces sarcomères au
les cellules peuvent en produire, mais les modèles
niveau
suite à une activation cellulaire ou à un phénomène
départ
décrites
considérées
comme
comme
des
de
cellulaire
ventriculaires
entraîne
contiennent
le
phénomène
des
de
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
2
contraction myocardique. Le calcium (Ca2+) est le
MPs issues de ces derniers puisse porter cette
messager ubiquitaire essentiel pour cette activité
cytokine (Martinez et al., 2005 ; Tedgui et Mallat,
contractile. La propagation d’un potentiel d’action,
2006). TNF-α est une protéine impliquée dans
initié au niveau sinusal auriculaire cardiaque, le long
l’inflammation systémique et appartient à un groupe
du sarcolemme et du système tubulaire transverse
de cytokines qui stimulent la réaction inflammatoire
des cardiomyocytes induit une entrée de Ca2+ dans le
aiguë. Il existe deux formes de TNF-α, une forme
cardiomyocyte via l’ouverture des canaux calciques
transmembranaire et une forme libre (Horiuchi et al.,
potentiel-dépendants de type L (Long Lasting) (ICaL).
2010). Le TNF-α transmembranaire (26 kDa) est un
Cette entrée d’ions Ca2+ va activer des récepteurs-
précurseur de la forme soluble du TNF-α (17 kDa), on
canaux sensibles à la ryanodine (RYR) qui vont
le retrouve exprimé par les macrophages activés et il
2+
permettre une sortie massive de Ca du RS, i.e. le
transitoire calcique. Cette sortie de Ca
2+
peut-être clivé sous l’action d’une « TNF-α-converting
du RS est
enzyme » (TACE) pour générer la forme soluble du
amplifiée par un rétrocontrôle positif autocatalytique,
TNF-α. Cette forme soluble libre est capable de se
le mécanisme de CICR (« Calcium-induced Calcium
lier aux récepteurs TNF de type 1 et 2 (TNF-R1 et
Release ») (Lee et Keener, 2008). La concentration
TNF-R2) portés par les cardiomyocytes.
calcique passe de 10
l’activation
des
-8
à 10
-6
myofibrilles
M. Le Ca
et
2+
ainsi
induit
le
Une étude préliminaire réalisée dans des
raccourcissement sarcomérique, i.e. la contraction.
cardiomyocytes isolés de souris adulte, a permis de
2+
cytosolique doit ensuite
montrer que des MPs macrophagiques issues de la
diminuer pour permettre la relaxation de l’appareil
lignée RAW 264.7, ont pour effet de diminuer et de
contractile. Le Ca2+ est ainsi principalement (chez la
ralentir le raccourcissement des sarcomères (effet
souris 93%) repompé par la pompe ATPasique
inotrope négatif), sans affecter les transitoires
La concentration de Ca
SERCA
(« Sarco/Endoplasmic
Reticulum
2+
Ca -
calciques (Milbank et al., 2014). L’objectif de cette
ATPase ») du RS, et aussi (7%) expulsé par
étude a donc été de déterminer si le TNF-α est
l’échangeur Sodium/Calcium NCX et la Ca 2+ ATPase
effectivement porté par les MPs et si oui, s’il joue un
du sarcolemme vers le milieu extracellulaire (Bers,
rôle dans les effets observés des MPs sur la
2002).
performance contractile des cardiomyocytes murins
adultes. Un inhibiteur spécifique et irréversible des
5. Objectif de l’étude
Dans le cas de l’athérosclérose, l’inflammation au
récepteurs aux TNF-α, le SPD-304 (10μM ;
Calbiochem) a été utilisé afin de vérifier cette
implication du TNF-α.
niveau des artères coronaires implique l’activation
des monocytes/macrophages et la libération de MPs
dans la circulation sanguine, qui ainsi peuvent venir à
proximité des cardiomyocytes myocardique. Par
ailleurs, une expression importante du TNF-α par les
macrophages de la plaque d’athérome a été mise en
évidence, ce qui rend fortement probable que les
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
3
Matériel et méthodes
produites selon le type de stimulation. Un surnageant
a été obtenu par deux centrifugations de 750 g
1. Culture des macrophages
RAW 264.7 et obtention
des microparticules
macrophagiques
pendant 15 minutes, et de 1500 g pendant 5 minutes
1.1.
deux fois 45 min à 13 000 g. Les MPs contenues
Culture cellulaire de la
lignée RAW 264.7
afin d’éliminer les cellules et les différents débris
cellulaires. Les MPs contenues dans le surnageant
ont été isolées grâce à deux centrifugations
successives pendant 30 minutes à 13 000 g, puis
dans le surnageant ont été récupérées dans du NaCl
RAW 264.7 est une lignée de macrophages obtenue
à 0,9 % et conservées à 4°C jusqu’à leur utilisation.
à partir de souris (Mus Musculus) BALB/c (American
Type Culture Collection, Manasses, VA, USA). Ces
cellules ont été par la suite mises en culture dans un
milieu DMEM (Lonza), additionné de 10% de sérum
de veau fœtal (SVF) décomplémenté, de 1% de
2. Isolement des
cardiomyocytes
2.1.
Pénicilline/Streptomycine, et de 1% de L-gluthamine.
Les cellules ont été placées dans une atmosphère
humidifiée à 5% de CO2 et à 37°C. Le milieu a été
changé toutes les 48 heures, lorsque les cellules
étaient
à
90%
de
confluence
environ.
Les
macrophages RAW 264.7 utilisés dans cette étude
Les
Prélèvement des cœurs
de souris C57BL/6
adultes
souris
utilisées
pour
l’isolement
des
cardiomyocytes ventriculaires sont des mâles de
souche C57BL/6. Elles ont été soumises à un régime
standard et furent utilisées à l’âge de 14 semaines.
pour produire des microparticules l’ont été entre des
repiquages R3 et R10.
1.2.
Obtention des
microparticules
Les cardiomyocytes ventriculaires ont été isolés par
dissociation mécanique comme décrit précédemment
(Pinz et al, 2011). Les souris sont soumises à un
prétraitement par de l’héparine (Héparine Choay,
La lignée cellulaire de macrophages RAW 264.7 a
Sanofi
donc été utilisée pour la production de MPs. Les
intrapéritonéale). L’héparine permet d’éviter toute
cellules ont été réensemencées à une densité de
coagulation sanguine et éventuel infarctus. Après
Aventis,
Paris,
0,05
ml
par
voie
6
2.10 cellules/mL puis mises en culture comme décrit
vingt minutes, les animaux sont sacrifiés dans une
ci-dessus. La production de MPs a été déclenchée
cuve à CO2. Une incision thoracique est ensuite
par traitement durant 24 heures avec soit avec de
réalisée, afin d’exposer le cœur.
l’actinomycine D (ActD, 1μg/mL), soit avec de
l’interleukine-1β (IL-1β ; 10ng/mL) seul, soit du TNF-α
(5ng/mL) seul, soit du TNF-α et de l’IL-1β combinés.
Le traitement le plus efficace pour induire la
production de MPs est l’ActD, qui induit l’apoptose
des macrophages. Quatre types de MPs sont ainsi
2.2.
Montage Langendorff et
digestion enzymatique
Une fois détaché, le cœur est canulé par l’aorte et
placé sur le montage Langendorff. Les artères
coronaires du ventricule gauche sont donc perfusées
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
4
de façon rétrograde par une solution tampon HANKS-
concentration calcique du milieu est alors augmentée
HEPES sans Ca2+ ajouté, dite de lavage, à 37°C
durant une phase de réplétion en 4 étapes
(NaCl : 113 mM, KCl : 4,7 mM, KH2PO4: 0,6 mM,
successives de 5 min jusqu’à atteindre 1 mM.
KHCO3 : 10 mM, Na2HPO4 : 0,6 mM, NaHCO3 : 12
mM, HEPES : 10 mM, MgCl2 :1,2 mM, glucose : 5,5
Pour les études par Western-Blot, les cardiomyocytes
mM, taurine : 29 mM, pH ajusté à 7,4 avec du NaOH
sont ensuite déposés dans des boites de Pétri (35
5N) ce qui permet d’enlever toutes traces sanguines
mm de diamètre) prétraitées avec de la laminine (20
dans les artères coronaires. Du 2,3-Butanedione
mg/mL) en présence d’une solution de Tyrode (NaCl :
monoxime (BDM, 10 mM) est ajouté dans cette
113mM, KCl :4,7mM, MgCl2 : 1,2 mM, Na2HPO4 : 0,6
solution de lavage. Il s’agit d’une substance
mM, NaHCO3 : 4,4 mM, HEPES : 20 mM, glucose :
cardioplégique qui d’inhibe l’ATPase de la myosine et
10 mM, taurine : 20 mM, Na pyruvate : 3 mM, CaCl2 :
empêche rapidement et réversiblement la formation
1,25mM, pH : 7,35) pendant 2-3 heures.
des ponts entre actine et myosine. Cela permet au
cœur de rester en permanence relaxé et prévient les
Pour les études fonctionnelles, ce n’est pas la boite
dommages dus aux contractions terminales, à
de Pétri qui est prétraitée avec de la laminine (20
l’ischémie et à la reperfusion (Louch et al, 2011).
mg/mL) mais une lamelle de verre (Corning, 25x25
Toutefois, l’utilisation de ce milieu très réduit en Ca 2+
mm) placée à l’intérieur de la boite de Pétri (35 mm)
entraîne une fragilisation du sarcolemme qui peut
en présence de la même solution de Tyrode pendant
+
induire une accumulation de sodium (Na ). Si bien
que lors de la réintroduction du Ca
2+
2-3 heures.
extracellulaire,
l’échange Na+/Ca2+ est dans le sens d’une entrée de
Ca2+, ce qui va induire une surcharge en Ca 2+
intracellulaire dramatique pour la survie de la cellule.
C’est pourquoi la solution de lavage contient aussi de
la taurine (3 mM) qui permet de protèger les cellules
contre ce phénomène appelé « paradoxe calcique ».
Il existe en effet un symport taurine/Na + permettant
de vider la cellule d’une surcharge de sodium.
3. Analyse fonctionnelle :
Mesure de la contraction
et du transitoire calcique
des cardiomyocytes
isolés
3.1.
Ensuite, une solution de lavage contenant de la
Marquage des
cardiomyocytes par la
sonde Fura-2AM
Liberase (Solution commerciale contenant différents
types de collagénases ; Roche, 10 ml/mL) est
Les cardiomyocytes sont chargés ou non avec du
perfusée jusqu’à ce qu’une augmentation du débit
Fura-2AM
d’écoulement soit observée (6-9 min), ce qui
Molecular Probes, 1μM dans du DMSO [diméthyl
témoigne d’une bonne digestion des connections
sulfoxide]) à température ambiante et obscurité
intercellulaires. Une fois digéré, le cœur est détaché
pendant 20 minutes, puis lavés durant 5 minutes
par coupure au niveau des oreillettes. Puis, les
avec la solution de Tyrode afin de permettre la
cellules sont dissociées par séparation mécanique,
(ester
acétoxyméthylé
perméant,
désestérification du Fura-2 intracellulaire.
filtrées et mises à sédimenter pendant 10 minutes. La
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
5
3.2.
Systèmes
d’enregistrement
en duplicate sur une plaque 96 puits. 25 μL de réactif
A (BioRad), contenant des ions Cu2+, sont ensuite
Les raccourcissements des sarcomères et les
transitoires
calciques
ont
été
enregistrés
simultanément en imposant une stimulation électrique
de champ (0,5 Hz, 0,1 ms, 7-15 V) à l’aide du
système IonOptix (Myocyte Calcium and Contractility
Recording System, Dublin, Irlande) couplé à un
microscope à fluorescence inversée (Episcopic
fluorescence
attachment
ef-inv-II ;
Inverted
microscope AE30-31). La contraction des sarcomères
est enregistrée à une fréquence de 500 Hz tandis que
les transitoires calciques sont enregistrés à une
fréquence de 250 Hz. Les réponses sont analysées
avec le logiciel IonWizard 6.3 (IonOptix).
ajoutés. Les atomes d’azote contenus dans les
liaisons peptidiques des protéines réduisent ces ions
Cu2+ en ions Cu+. Puis, 200 μL d’un réactif B
(BioRad) sont ajoutés. Ce dernier va former un
complexe de couleur bleu avec les ions Cu+. La
plaque est laissée à incuber 10 minutes à l’abri de la
lumière puis l’absorbance est mesurée à 570 nm
grâce à un lecteur de microplaques (Mithras LB 940,
Berthold technologies). La détermination de la
concentration
se
fait
par
comparaison
avec
l’absorbance mesurée d’une gamme étalon de BSA
(« Bovine serum albumine ») 5%.
4.2.
Western-Blot
Les protéines sont séparées sur un gel de poly-
4. Analyse moléculaire
Suite aux différentes stimulations, les cardiomyocytes
sont détachés par grattage, puis les protéines en sont
extraites. Pour cela, les cellules sont récupérées
dans des tubes eppendorf et centrifugés à 500g
pendant 5 minutes à 20°C. Le culot est repris dans du
PBS, puis centrifugé à 1500g pendant 5 minutes. Le
surnageant est ensuite éliminé et le culot plongé dans
l’azote liquide. Dans un premier temps, le dosage des
protéines est réalisé selon la méthode de Lowry. Ce
dosage permet d’orienter la manière dont il est
possible d’exploiter l’échantillon par la suite et
notamment de savoir si la quantité de protéines est
suffisante pour une détection par Western-Blot. Le
reste de l’échantillon est ensuite utilisé pour réaliser
des Western-Blot.
4.1.
Dosage des protéines
acrylamide (Novex Protein from Life technologies,
NuPAGE 4-12% Bis-Tri Gel ; 1,0 mm X 12 well ou 1,5
mm X 10 well) pendant 90 minutes à 150 V, puis
transférées sur une membrane de nitrocellulose
pendant 90 minutes à 110 V à 4°C. La membrane est
alors colorée au rouge Ponceau puis saturée avec
une solution de sérum d’albumine bovine (BSA) à 5%
pendant 90 minutes à température ambiante afin
d’éliminer les sites de fixation non spécifiques.
Ensuite, la membrane est mise à incuber avec
l’anticorps
primaire
pendant
90
minutes
à
température ambiante, ou à 4°C durant la nuit. Le
lendemain, 3 lavages de 10 minutes au TBS-Tween
(Tris buffered saline and Tween) (20 mM Tris ;
61,5mM NaCl ; 0,1% Tween) sont effectués afin
d’éliminer
l’anticorps
en
excès.
L’anticorps
secondaire couplé à la peroxydase est alors mis à
incuber avec la membrane pendant 90 minutes à
température ambiante, puis une autre série de
Le dosage des protéines a été réalisé en suivant le
protocole de Lowry. 5 μL d’échantillons sont déposés
lavages, 3 fois 10 minutes, avec du TBS-Tween est
effectuée.
Les
protéines
sont
révélées
par
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
6
chemiluminescence soit avec du luminol (Santa Cruz)
Résultats
pendant 1 minute, soit grâce au kit de révélation
SuperSignal® West Femto Maximum Sensitivity
Substrate (ThermoScientific, Fischer) pendant 3
minutes. La révélation s’effectue grâce à un système
1. Le TNFαest présent dans
les MPs macrophagiques
d’acquisition en chambre noire (ChemiSmart 500,
Le TNF-α a été détecté par Western-blot sur des
Vilbert Lourmat) et du logiciel Chemi-Capt 5.0. Les
extraits protéiques de MPs issues de macrophages
différents anticorps qui ont été utilisés sont l’anticorps
RAW 264.7 traitées avec de l’ActD (figure 1). Sur les
polyclonal anti-TNF-α (Santa Cruz, 1/500) produit
membranes de nitrocellulose, on peut notamment
chez la chèvre, l’anticorps polyclonal anti-α-tubuline
distinguer les bandes correspondant aux deux formes
(Santa Cruz, 1/500) produit chez la chèvre et l’anti-
de TNF-α, libre (17kDa) et transmembranaire
IgG de chèvre conjugué à HRP (Santa Cruz, 1/5000)
(26kDa).
produit chez l’âne.
5. Analyses statistiques
Les différentes bandes d’intérêt des Western Blot
sont quantifiées relativement à l’aide du logiciel BIO1D. Ces résultats sont exprimés en moyenne ± erreur
Figure 1 : Western-blot montrant la présence de
standard à la moyenne (ESM) de “n” expériences, i.e.
TNF-α dans les MPs
le nombre de souris étudiées. Les différences entre
Expression du TNF-α (n=3)
les groupes de données ont été comparées à l’aide
d’un Mann-Whitney non paramétrique à l’aide du
logiciel Prism 5.0. Une valeur de P inférieur à 0,05 a
été admise pour que les différences entre les
données soient considérées comme significatives.
Les résultats des analyes fonctionnelles sont
exprimés en moyenne ± ESM de « n » expériences,
i.e. le nombre de cellules étudiées. Les différences
entre les groupes de données ont été comparées sur
le logiciel Prism 5.0 à l’aide du test t (test de Student)
2. TNF per se induit un
effet inotrope négatif
L’étude de l’effet du TNF-α per se (800 U/mL) sur la
contractilité des cardiomyocytes (figure 2) indique
que le TNF-α a un effet inotrope négatif sur les
cardiomyocytes
dès
15
min
et
induit
un
ralentissement des cinétiques de raccourcissement et
de relaxation sarcomérique.
non apparié et par la méthode statistique ANOVA,
suivie d’un test de comparaisons multiples de
Bonferroni, pour les expériences utilisant les MPs.
Une valeur de P inférieure à 0,05 a été admise pour
que les différences entre les données soient
considérées comme significatives.
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
7
3. Le TNF-α n’a pas d’effet
sur les transitoires
calciques
L’étude de l’effet du TNF-α (800 U/mL) sur les
transitoires calciques des cardiomyocytes (figure 3)
indique qu’il n’y a pas d’effets significatifs du TNF-α
sur les différents paramètres du transitoire calcique.
Figure 2: Effet du TNF-α per se (800 U/mL) sur la
contractilité des cardiomyocytes
A : Amplitude maximale de raccourcissement (% de
variation de la longueur basale de sarcomère)
B : Vitesse maximale de raccourcissement (-dL/dt, en
μm/sec)
C : Vitesse maximale de réallongement (+dL/dt, en
μm/sec)
Les valeurs représentent les moyennes ± ESM; n=2428 cellules par groupe, *P<0.05 vs. Contrôle (CTRL).
Figure 3: Effets contrôles du TNF-α (800 U/mL)
sur les transitoires calciques des cardiomyocytes
A : Pourcentage de variation du rapport de
fluorescence F340/F380
B : Vitesse maximale de sortie de Ca2+ à l’extérieur
du RS (depV)
C : Temps au pic depuis t0 (milliseconde) (peak T)
D : Vitesse maximale de repompage du Ca 2+ (retV)
E : Constante de tps de repompage calcique (en
milliseconde) (TAU)
Les valeurs représentent les moyennes ± ESM; n=2428 cellules par groupe, *P<0.05 vs. Contrôle (CTRL).
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contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
8
4. Les MPS induisent un
effet inotrope négatif
5. Le SPD-304 inhibe l’effet
des MPs macrophagiques
L’étude de l’effet des MPs sur la contractilité des
L’étude de l’effet du SPD-304 (10 μM) sur l’effet
cardiomyocytes (figure 4) indique que les MPs ont un
inotrope négatif des MPs (figure 5) indique que Le
effet inotrope négatif rapide sur les cardiomyocytes
SPD-30 empêche l’effet inotrope négatif des MPs.
car
ils
induisent
une
diminution
des
raccourcissements sarcomériques.
Figure 4 : Effet des MPs à 1 et 10 μg/ml sur la
contractilité des cardiomyocytes
A : Enregistrement typique des raccourcissements
sarcomérique
B : Enregistrement typique des transitoires calciques
C : histogramme présentant l’effet des MPs à 1 et 10
μg/ml sur le pourcentage de raccourcissement
sarcomérique.
Les
valeurs
représentent
les
Figure 5: Effet du SPD-304 (10 μM) sur l’effet
moyennes ± ESM; n=28-50 cellules par groupe,
*P<0,05 vs. contrôle (CTRL).
inotrope négatif des MPs
A:
Pourcentages
des
raccourcissements
sarcomériques des cardiomyocytes étudiés par
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
9
vidéo-imaging en présence ou non de MPs et de
d’expression de protéines impliquées dans le
SPD-304
couplage excitation-contraction.
B : Vitesse maximale de contraction sarcomérique
(depV, μm/sec)
Les
C : Vitesse maximale de relaxation sarcomérique
transmembranaire est porté par les MPs issues des
(retV, μm/sec)
macrophages RAW 264.7 traités avec de l’Act D. De
Les valeurs représentent les moyennes ± ESM; n=16-
plus, il a été montré que le TNF-α transmembranaire
50 cellules par groupe, *P<0,05 vs. contrôle (CTRL).
est capable d’intéragir avec le TNF-R1 et le TNF-R2
résultats
indiquent
que
le
TNF-α
(Horiuchi et al., 2010). Ces récepteurs TNF-R1 et
TNF-R2 se retrouvent exprimés à la surface des
Discussion
cardiomyocytes (Higuchi et al., 2004).
Lors de cette étude, la présence de TNF-α a bien été
confirmée dans les MPs. De plus le TNF-α a un effet
Il n’y a pas eu d’effet observé des MPs sur le
inotrope négatif sur la contraction, i.e. provoque une
transitoire calcique. Il est néanmoins possible qu’il y
diminution de la contractilité des cardiomyocytes.
Cependant, cette diminution de la contractilité ne
s’accompagne pas d’une modification des transitoires
ait un effet et que cet effet ne soit pas détectable
avec la technique utilisée ou que la libération de Ca 2+
à partir du RS cache la diminution éventuelle de
calciques. Nous avons confirmé que les MPs
l’entrée de Ca2+ par ICaL. Cependant, d’autres
induisent un effet inotrope négatif. L’inhibition de la
travaux indiquent que le TNF-α aurait plutôt un effet
voie du TNF-α par son inhibiteur SPD-304 rétablie la
sur la sensibilité des protéines contractiles au Ca 2+
contractilité normale. L’ensemble de ces résultats
(Goldhaber et al., 1996). En présence de TNF-α, la
suggère que le TNF-α est impliqué dans l’effet
sensibilité des protéines contractiles, comme l’actine,
inotrope négatif des MPs issues de macrophages sur
la myosine ou la troponine I au Ca2+ serait diminuée.
la contractilité des cardiomyocytes.
Il existe un autre mécanisme d’intéraction potentiel
Conclusion
entre MPs et cardiomyocytes différent de l’intéraction
La voie du TNF-α pourrait donc bien être impliquée
l’internalisation.
processus
dans l’effet des MPs macrophagiques sur la
d’internalisation des MPs sur des cardiomyocytes a
contractilité des cardiomyocytes. Il serait maintenant
déjà été étudié (Milbank et al., 2014). Il a ainsi été
intéressant de confirmer l’implication du TNF-α porté
montré que les MPs commencent à être internalisées
par ces MPs en explorant diverses voies de
ligand-récepteur,
seulement
après
1
heure
au
Ce
contact
d’un
signalisation
du
TNF-α,
comme
la
voie
du
cardiomyocyte, tandis que l’effet inotrope négatif des
NO/cGMP/PKG, la voie phospholipase A2/acide
MPs est observé seulement après 5 minutes.
arachidonique et la voie sphingosines. Différents
L’implication de ce mode d’action est donc écartée.
inhibiteurs pharmacologiques pourraient être utilisés
Le temps de traitement avec les MPs est également
comme la L-Nitroarginine (LNA) qui est un inhibiteur
trop
de la « nitric oxide synthase » (NOS), l’ODQ (1H-
court
pour
entraîner
des
modifications
[1,2,4]oxadiazolo-[4, 3-a]quinoxalin-1-one) qui est un
Grimaud Joaquim | Implication de la voie du TNF-α dans les effets de microparticules macrophagiques sur la
contractilité de cellules cardiaques isolées de souris adultes
10
inhibiteur de la guanylate cyclase soluble (GCs), le
-
KT 5823 qui est un inhibiteur de la protéine kinase G
(PKG),
l’AACOCF3
(Arachidonyl
Shedding microvesicles: artefacts no more.
trifluoromethyl
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12
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