04 10 2016 10h15 11h15 Virologie Pr Goffard B4 B3 .pdf



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Auteur: Essia Joyez

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2016-2017

Méthodes de diagnostic utilisées en virologie
Méthodes de diagnostic utilisées en virologie

– UE VII : Virologie infectiologie –
Poly du cours distribué en amphi (dispo sur moodle)
Semaine : n°5 (du 01/10/2016 au
05/10/2016)
Date : 04/10/2016

Heure : de 10h15 à
11h15

Binôme : n°04

Professeur : Anne Goffard
Correcteur : n°03

Remarques du professeur (Diapos disponibles, Exercices sur le campus, Conseils, parties importantes
à retenir, etc.)
→ La mise à jour du cours avec le bon schéma arrive sur moodle prochainement
Les schémas des techniques tombent à l'examen



PLAN DU COURS

I)

Introduction

II)

Diagnostic indirect

A)

Elisa

B)

Western Blot

III)

Diagnostic direct

A)
1)

Principe

2)

Intérêts et limites de l'isolement viral.

B)

Recherche d'Ag viraux par méthodes immunologiques

1)

Immunofluorescence

2)

ELISA

C)
IV)

Isolement viral en culture cellulaire

Recherche des génomes viraux
Prélèvements biologiques à visée diagnostique en virologie

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I)

Méthodes de diagnostic utilisées en virologie

Introduction

En virologie, on utilise des méthodes de laboratoires que l'on connait déjà : ELISA, immunofluorescence, PCR.
On décide si on veut faire un diagnostic direct ou indirect.
Diagnostic direct : on met en évidence le virus lui même ou un de ses constituants (Ag viral, protéines virales,
génome viral de type ADN ou ARN).
Diagnostic indirect : on recherche les anticorps contre les constituants d'un virus, on recherche la réaction
immunologique qui s'est produite en réaction à une infection. Ce sont des techniques de sérologie.
→ On recherche alors les Ac synthétisés par le patient en réaction d'une infection virale.

II)

Diagnostic indirect

On cherche à mettre en évidence dans un échantillon biologique des anticorps dirigé contre un virus.
Pour cela, on utilise :


ELISA



Western Blot.

Au cours d'une infection, on synthétise des Ac. Les plus précoces sont les IgM. Quand les IgM sont présents chez
le patient, c'est que l'infection est en cours. On parle d'infection aiguë.
Plus tard au cours de l'infection, on voit apparaître des IgG.
En virologie, on ne s'intéresse pas aux IgA.
(Cf cours immuno : différence de structure entre IgM et IgG.)
→ Les IgM sont les marqueurs d'une infection récente, précoce, aiguë.
→ Les IgG sont les marqueur d'une infection ancienne, guérie ou non.

Il faut connaître tous les schémas des techniques, elle peut demander ça à l'examen !!!

A)

ELISA permettant la recherche d'Anticorps

(Attention !! il y a une erreur de schéma dans le poly : le schéma dans la partie ELISA n'est pas le bon.)
On a des microplaques (vendues par les sociétés commerciales) destinées au diagnostic.
Sur les plaques, sont fixés des Ag viraux. On y dépose le sérum du patient. Les Ac présents dans le sérum du
patient vont se fixer sur les Ag. Après incubation, on lave. On va révéler le complexe Ag-Ac qui s'est formé au
fond de la plaque grâce à une Immunoglobuline marquée avec un marqueur colorimétrique dirigée contre les Ig
humaines. On ajoute le substrat de l'enzyme qui donne une réaction colorée et on mesure la densité optique dans
le puit. Cela nous permettra de savoir s'il y a des Ac.
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Méthodes de diagnostic utilisées en virologie

Intérêts de l'ELISA :


Totalement automatisé :


Moins de risques d'erreur.



Plus rapide : traite un grand nombre d'échantillons



Rapide



Peu couteux
Le coût d'une analyse de sérologie coûte 0,017€ au CHU de Lille, grâce à l'automatisation.

Remarque : On a différents automates capables de réaliser les ELISA : par recherche unitaire, en microplaques, par
séries...

B)

Western Blot : recherche d'Anticorps

On a vu la méthode en Biologie cellulaire en 2A pour mettre en évidence des protéines mais ici on ne l'utilise pas
de la même façon. Le Western Blot pour faire le diagnostic du HIV n'est pas une technique de biologie
moléculaire.
On l'utilise pour mettre en évidence des Anticorps.
Cela est fait dans les industries pharmaceutiques. Ils cultivent des souches virales du HIV. Ils homogénéisent,
inactivent et séparent les protéines virales. Ils ont donc une préparation dans laquelle il y a les protéines virales en
suspension.
Ils vont déposer la préparation dans des puits en haut du gel de polyacrylamide et on fait migrer avec un gradient
électrique. Les protéines virales se séparent en fonction de leur taille : les plus grandes seront en haut et les plus
petites en bas. Ils transfèrent le tout sur une membrane de nitrocellulose et ils refont passer un courant électrique.
On a donc les plus grosses protéines en haut, les plus petites en bas.

→ On obtient des bandelettes de nitrocellulose avec sur chaque colonne des protéines fixées, séparées en fonction
de leur taille.
Le laboratoire de virologie achète les bandelettes faites. On dépose le sérum du patient suspect d'une infection au
HIV sur la bandelette, on incube, on lave. On révèle en utilisant un Ac monoclonal anti Ig humaine marquée avec
une enzyme. On voit apparaître des bandes colorées.
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Méthodes de diagnostic utilisées en virologie

Exemple d'un patient suspect d'une infection par le HIV.
Sérum 1 :
Il y a une bande de contrôle pour affirmer qu'on a mis du sérum sur la bandelette. On a une seule bande qui
apparaît : dans le sérum du patient il y a des Ac dirigés contre la protéine p24 (marqueur d'une primo infection par
le HIV)
Sérum 2 : (3 semaines après)
Bande de contrôle toujours présente. On remarque que la bande correspondant à la réaction contre la protéine p24
est plus forte en intensité. On voit apparaître des Ac dirigés contre une autres protéine : la gp160.
Cela montre que pendant les 3 semaines entre cette bandelette et la précédente, le patient était bien infecté par le
HIV : il a synthétisé des Ac dirigés contre les protéines virales.
Sérum 3 : (3 mois après)
Marque de contrôle positive. Le patient présente des Ac dirigés contre toutes les protéines virales.

On utilise peu le Western Blot en virologie. La seule application est la confirmation du dépistage de HIV.
Intérêts et applications :


technique de confirmation


moins sensible que l'ELISA



permet de caractériser les Ac



en partie automatisée



peu couteuse

Ce qu'on doit savoir faire :




Décrire le principe de l'ELISA pour la recherche d'Ac
Expliquer les applications de l'ELISA pour la recherche d'Ac
Décrire le principe du Western Blot et présenter une application
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III)

Méthodes de diagnostic utilisées en virologie

Diagnostic direct

On cherche à mettre en évidence soit le virus lui-même dans un échantillon biologique soit un de ses constituants
(protéines virales ou antigènes, génomes viraux)
Il n'y a jamais de microscopie électronique en virologie : on utilise l'isolement viral en culture cellulaire, la
détection d'Ag par des méthodes immunologiques (ELISA et immunofluorescence), l'étude du génome viral par
biologie moléculaire.

A)

Isolement viral en culture cellulaire

On tente à partir d'un échantillon in vitro de reproduire la réplication virale. Si on multiplie un virus in vitro, ça
veut dire qu'il était entier dans l'échantillon.
Le but est de savoir si dans un échantillon donné, il y a un virus infectieux. J'ai à ma disposition l'isolement viral
en culture cellulaire : j'ai des cellules sur lequel je peux déposer le virus et voir si il se réplique.
C'est une technique longue et couteuse, qui disparaît peu à peu mais ça reste pour l'instant la technique de
référence.

1)

Principe

Est ce que le patient présentant les signes cliniques est infecté par un virus ?
On essaye de démontrer que dans l'échantillon biologique, on a un virus infectieux qui se réplique. Or, tous les
virus ne se multiplient pas dans n'importe quelle cellule. Il n'existe pas un type cellulaire sur lequel tous les virus
se répliquent. On a donc pleins de systèmes cellulaires différents.
On utilise principalement des cellules adhérentes (= cellules adhérant à un support)
On a des milieux de culture dans lequel on ajoute des AA, du sérum de veau, des antibiotiques et des
antifongiques.
On a des étuves à 37°C sous 5% de CO2, pour que le virus reste en vie et puisse se multiplier.
Le plus souvent, on utilise des cellules humaines d'origine tumorale.

Par exemple : Hep2 (cellules de carcinome de larynx) et HeLa (cellules de
carcinome de col utérin). Les cellules adhérentes forment un tapis
cellulaire.
On a des échantillons de patient dans lequel on recherche un virus
infectieux. On dépose sur le tapis cellulaire quelques gouttes du
prélèvement biologique que l'on a reçu. Ca peut être n'importe quoi :
salive, liquide amniotique, sang, sérum, plasma, LCR, crachat, sécrétion
oeso-pharyngée...
Cela se fait dans des laboratoires spécifiques avec un niveau de sécurité
L2. Les techniciens de laboratoires sont qualifiés : ils mettent l'échantillon
sur les cellules et on incube.
Certains virus donnent un effet cytopathogène.

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Méthodes de diagnostic utilisées en virologie

Effet cytopathogène (ECP) + + +
= ensemble des altérations cytologiques observées lors de la réplication virale.

Par exemple, sur les cellules Hep2. Après incubation du liquide biologique, on voit des trous : les cellules ont été
lysées par la réplication virale. Autour, on voit de grosses cellules réfringentes qui vont bientôt de décoller. Le
tapis a un aspect en dentelle, caractéristique d'un AdenoVirus.
L'ECP dépend de la lignée cellulaire ensemencée et du virus qui se réplique.
L'ECP dépend de la durée du cycle de réplication viral et de la quantité de virus qu'il y avait dans
l'échantillon initial.
→ Le délai d'apparition d'un ECP est variable : entre 2 jours et 6 semaines

2)

Intérêts et limites de l'isolement viral.

INTÉRÊTS :


Mise en évidence du virus : à la fin, si le virus se réplique, on a du virus infectieux : c'est utilisé pour tester
des antiviraux dans les laboratoires de recherche ou dans les industries pharlaceutiques.



peu cher

LIMITES :


Labos et techniciens spécialisés.



Délai d'obtention des résultats long.



!! Certains virus ne donnent pas d'ECP (virus grippe). Ils se multiplient bien dans les cellules mais ne
modifient pas les cellules : on est obligé au bout de 48 à 72h qu'on a mis le virus en contact avec les
cellules de récupérer les cellules et de chercher dedans les protéines virales (par immunofluorescence sur
les cellules étudiées).



!! Certains virus ne se multiplient pas en culture cellulaire (hépatites)

On ne peut pas utiliser uniquement cette méthode là pour faire du diagnostic
→ L'isolement cellulaire est de moins en moins utilisé.

APPLICATION :
Diagnostic d'une infection par le CMV (cytomégalovirus) d'un nouveau né. (le CMV donne des
malformations embryonnaires foetales). Le CMV est un virus de la famille des herpès qui
s'élimine dans les urines. On prélève les urines du bébé, et on les incube sur un tapis cellulaire. On
attend de voir si le virus se réplique : on peut attendre jusqu'à 6 semaines.
Aspect en banc de poisson spécifique au CMV.
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B)

Méthodes de diagnostic utilisées en virologie

Recherche d'Ag viraux par méthodes immunologiques

1)

Immunofluorescence

On récupère un échantillon biologique dans lequel il doit y avoir des cellules infectées.
On fixe les cellules sur une lame de verre. On perméabilise les membranes de façon à ce que les Ac puissent
entrer dans les cellules. On incube les cellules avec un Ac primaire dirigé contre les protéines virales. Si il y a des
complexes Ac-Ag qui se forment, on détectera les Ac primaires avec un Ac secondaire marqué à la fluorescence :
généralement monoclonal dirigé contre les Ig humaines.
Connaître le schéma !!
Application :
Par exemple, ici, on a des prélèvements naso-pharyngées réalisés chez un enfant
qui présente une pathologie pulmonaire: la bronchiolite du nouveau-né. On a bien
des cellules dans le prélèvement et on voit de la fluorescence à l'intérieur des
cellules : il y a des cellules infectées par le virus.


Mise en évidence des virus respiratoires



permet simultanément détection et identification du virus



méthode rapide (on a un résultat en 2h30-3h environ) et assez sensible



ne permet pas de conclure à l'infectiosité du virus présent.

2)

ELISA

Microplaques au fond desquelles sont fixées des Ac dirigées contre l'Ag viral qu'on recherche. On dépose le
sérum du patient qui est censé contenir cet Ag viral. Il y a un complexe Ag-Ac qui se forme.
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Méthodes de diagnostic utilisées en virologie

Après incubation, on dépose ensuite un autre Ac qui reconnaît l'Ag marqué par une enzyme. On ajoute le substrat
de l'enzyme, cela donne une réaction colorée. On mesure la densité optique et on peut conclure voire quantifié
l'antigène présent dans le tube.


automatisable



sensible et spécifique



aide au diagnostic

On l'utilise pour rechercher des Ag viraux secrétés au niveau d'une infection virale : par exemple l'Ag p24 au cours
de l'infection par le HIV, la protéine HBs et HBe au cours de l'infection par l'hépatite B.
Remarque : il n'y a sécrétion de protéine virales pour tous les virus : c'est utilisé seulement pour certains virus.
Exemple : Au cours de l'infection par le HIV, la protéine p24 est sécrétée dans le sang. On peut faire un ELISA
spécifique pour rechercher les Ag p24.
Au début de l'infection, il n'y a pas encore d'Ac dirigé contre l'Ag p24 donc on peut détecter l'antigène p24 → c'est
le marqueur de la primo-infection.
Plus tard au cours de l'infection, des Ac anti p24 vont se complexer aux Ag p24, ainsi, on ne pourra plus les
détecter.
→ La détection de l'Ag p24 par ELISA est le marqueur de la primo-infection par le HIV.

C)

Recherche des génomes viraux

PCR/RT PCR : ce sont des techniques de plus en plus utilisées.
Ce sont les outils qui remplacent l'isolement viral en culture
cellulaire.
A partir d'un échantillon biologique, on veut savoir si dans
l'échantillon il y a de l'ARN ou de l'ADN viral. On peut non
seulement détecter mais aussi doser : techniques qualitative et
quantitative.
Il faut faire l'extraction d'acide nucléique.
Si on suspecte la présence d'un virus de type ARN, avant la PCR
il faut faire la transcription inverse. (RT PCR)
Amplification par RT PCR en temps réel pour le diagnostic en virologie :


sensibilité +++



spécificité +++



en cours d'automatisation



rapide +++

PCR en temps réel :
On a une génération d'une courbe de fluorescence.
On peut amplifier une gamme et ainsi on va pouvoir générer une
droite permettant de quantifier le nombre de copies de génomes
viraux présents dans les échantillons que l'on va tester. C'est ce
qu'on appelle la charge virale utilisée pour l'hépatite B, C et le HIV.
C'est utilisé quand on a besoin de quantifier : CMV par exemple.
Pour la grippe, on n'a pas besoin de quantifier, on n'utilise donc pas
la PCR.

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Méthodes de diagnostic utilisées en virologie

Ce qu'on doit savoir faire :





Expliquer le principe de l'isolement viral en culture cellulaire
Expliquer ce qu'est un effet cytopathogène
Expliquer les principes de l'immunofluorescence et de l'ELISA pour rechercher des antigènes viraux
Donner des exemples d'application de ces outils

IV)

Prélèvements biologiques à visée diagnostique en virologie

Le prélèvement doit être :


pertinent pour le malade : on ne va pas prélever des urines si le virus est dans le nez



utilisable par le laboratoire : il ne faut pas attendre trop longtemps avant de le déposer au labo.

Différentes questions à se poser :




Pertinent


Quand prélève-t-on le patient ? Pour le diagnostic direct il faut faire le prélévement quand le patient
est malade.



Qu'est ce que je prélève ? On prélève l'organe malade



Comment faire le prélèvement ? Quel matériel ? Quel contenant ? Quel acheminement ?

Utilisable


Identifié



correctement conservé et acheminé au laboratoire



accompagné de renseignements cliniques

Conclusion : Savoir :


définir le diagnostic direct et indirect en virologie



Présenter les méthodes du diagnostic indirect



Expliquer quelques applications du diagnostic indirect



Présenter les méthodes du diagnostic direct



Expliquer quelques applications du diagnostic direct



Expliquer les règles de prélèvement d'un échantillon biologique pour le diagnostic virologique.

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