polycopié TP2 2018 2019

TP DEVELOPPEMENT (UE RPC, L3)
- 2018-2019 MODÈLE AMPHIBIEN XENOPUS LAEVIS
Xenopus laevis communément appelé xénope est un batracien de l’ordre des anoures,
dépourvu de queue à l’état adulte. C’est un animal aquatique. C’est un modèle très utilisé en
Biologie du Développement.
Le but de ce TP est de vous enseigner des techniques utilisées couramment dans des
laboratoires d’embryogenèse et de compléter les enseignements théoriques et
méthodologiques vus en cours et TD par l’observation et la manipulation d’embryons vivants
ou fixés.

Objectifs
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø

Apprendre des techniques utilisées dans des laboratoires d’embryogenèse
Compléter les enseignements théoriques et méthodologiques vus en cours
Comprendre les difficultés liées à l’utilisation du matériel vivant.
Apprendre à manipuler sous loupe binoculaire et à observer du matériel vivant et fixé
Comprendre la régulation de divers processus cellulaires :
• Identifier les stades clés du développement de X. laevis, que ce soit lors de
l’ovogenèse ou de l’embryogenèse.
• Identifier les différents blastomères et suivre leur devenir.
• Comprendre et réaliser des expériences perturbant le développement
embryonnaire (perturbation des axes).
• Comprendre et réaliser les expériences de la calotte animale.
• Apprendre à analyser des résultats d’une expérience scientifique et à être
critique sur les résultats obtenus.

- Des rappels d’histologie et de plan d’organisation des vertébrés, en utilisant l’embryon de
xénope comme modèle, seront également faits lors de ce TP.
-

-

Comme pour le TP1, un compte rendu vous sera demandé dont une partie que vous devrez
rendre à la fin du TP
Il vous est donc demandé de connaître le principe des techniques utilisées et des enzymes
utilisées. De plus, vous devez connaitre le protocole des expériences réalisées et être
capables d’analyser et expliquer les résultats de celles-ci.
Des documents supplémentaires sont sur Moodle et doivent être également connus. Ces
documents vous aideront à comprendre ce TP et à analyser les résultats obtenus.
Une partie de ce TP a été publiée dans l’article scientifique à but pédagogique IJDB
(2003), également déposé sur Moodle sera à votre disposition au cours de ce TP. Il est
vivement conseillé de feuilleter cet article.
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Programme du TP
Ø Première ½ journée
Embryogenèse :
Fécondation in vitro des ovules et observation des conséquences de la fécondation et des
premiers stades du développement embryonnaire.
Expériences de perturbation des axes (LiCl et Choc thermique)
Expériences de l’effet de la température sur le développement embryonnaire
Ø Deuxième ½ journée :
Ovogenèse :
Observation et tri des ovocytes ; extraction de la vésicule germinative
Embryogenèse :
Expériences d’inductions dans les calottes animales
Suivi des embryons des expériences débutées lors de la première séance
Ø Troisième ½ journée :
Observation et analyse de toutes les expériences débutées lors des deux premières séances

Tous les milieux et matériels
(boites, testicules, ovocytes)
nécessaires à ce TP sont
placés sur l’étagère au-dessus
des paillasses

.
2



1. Ovogenèse : Manipulation des ovocytes de xénope
1.1 Obtention des ovocytes
Une femelle est opérée afin de prélever un lobe d’ovaire (Figures 1 et 2). Celui-ci est placé
dans le milieu OR2 sans calcium additionné de collagénase à 2mg/ml. L’ensemble est placé
sous une agitation douce pendant 2 h à 20ºC. Les ovocytes sont lavés plusieurs fois dans le
milieu OR2 sans calcium puis placé dans une solution d’OR2 avec calcium. Les cellules
folliculaires résiduelles sont enlevées manuellement à l’aide de pinces.

Figure 1 : incision ventrale pour
extraire les lobes d’ovaires

Figure 2 : lobes d’ovaires avant
traitement à la collagénase

1.2 Caractéristiques des ovocytes
On peut dénombrer 6 stades ovocytaires qui présentent des caractéristiques morphologiques
externes (Taille, Pigmentation) (Figure 3), qui sont répertoriés dans la table de Dumont
(1972) (Tableau ci dessous), mais également des caractéristiques internes (Figures 4, 5, 6 et
7 et documents déposés sur Moodle).

Figure 3: Photographies des 6
stades d’ovocytes

STADE TAILLE (µm)
ASPECT
Stade du cycle
I
50-300
Transparent
Prophase I
II
300-450
Blanc
Prophase I
III
450-600
Brun clair
Prophase I
IV
600-1000
Séparation PA/PV ; PA brun foncé
Prophase I
V
1000-1200
Idem mais PA brun clair
Prophase I
VI
1200-1300
Bande claire à l’équateur
Prophase I

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Lampbrush chromosomes ou chromosomes
en écouvillon: Représentation schématique
des boucles d’ADN qui sont le siège d’une
TCT active de l’ADN en fibrille d’ARN
immédiatement recouvertes de riboproteines
pour les stabiliser. Ces boucles donnent un
aspect plumeux au chromosomes, d’ou leur
nom.
Figure 4 : Diagrammes des taux de synthèse des ARN et ADN pendant l’ovogénèse et
début du développement embryonnaire et représentation schématique des chromosomes
en écouvillon des ovocytes

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Figure 5 : Corps de
Balbiani (ovocytes
pré-vitellogéniques)

Axe Hypothalamus-Hypophysaire
Hormones Gonadrotropines (FH+FSH)

Cellules Folliculaires
Ovocyte (Stade III-Stade IV)
Oestrogènes

Foie

Vitellogénine
Voie sanguine
Membrane plasmique
(récepteurs)

Endocytose
Clivage
Phosvi;ne + Lipovitelline
Figure 6 : Vitellogenèse
(Ovocytes stades III-IV)

Figure 7 : Maturation des ovocytes
(stades V-VI) et reprise de la méiose

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1.3 Tri des ovocytes
Prélever des ovocytes dans la boite stock et les placer dans une boite de 60 mm dans du
milieu OR2 additionné de calcium. Aligner dans votre boîte 3 à 5 ovocytes de chaque stade
et valider votre alignement par un enseignant. Comparer les ovocytes de stade VI triés avec
les ovules (ovocyte VI matures) pondus par la femelle (Figure 8). Noter leurs différences.

Figure 8

1.4 Extraction du noyau de l’ovocyte
Le noyau de l’ovocyte est appelé vésicule germinative (VG) et est localisé dans l’hémisphère
animal. Ce noyau a un diamètre de 300 microns et il est 105 fois plus grand que celui d’une
cellule somatique.
Extraire la VG d’un ovocyte de stade VI. Piquer le pole animal avec une aiguille et observer
la sortie de la VG sous la loupe tout en pressant l’ovocyte tenu avec la pince.

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2. Embryogenèse : Manipulation des embryons de xénope
2.1 Obtention des ovules et des testicules
Les embryons ont obtenus par fécondation artificielle.
Les femelles sont stimulées par voie hormonale la
veille de la fécondation en injectant par voie
sous-cutanée de l’hormone gonadotrophine
Figure 9: Injection de l’hormone humaine hCG
chorionique humaine (Figure 9).

dans les sacs lymphatiques dorsaux d’une femelle

Le mâle a été sacrifié la veille afin de prélever les testicules, conservés à 4ºC dans du
MMR 1X en présence de gentamycine.
Le matin de la fécondation, les femelles sont placées dans un aquarium dans du milieu
HSB 1X et laissées à pondre. Pourquoi ne pas laisser la femelle pondre dans l’eau ?
2.2 Fécondation in vitro
La pénétration du gamète male dans le gamète femelle entraine plusieurs changements
morphologiques et fonctionnels conduisant à la fin de la méiose et permettant ainsi la
fécondation et le début du développement embryonnaire mais aussi à éviter la polyspermie
(voir les documents sur Moodle). L’observation de ces changements morphologiques permet
de vérifier rapidement et avant la première division qu’il y a bien eu fécondation.
1. Récolter dans une boite de 60 mm de diamètre les ovules pondus par la femelle. Eliminer le
milieu et frotter le testicule sur cette monocouche d’ovules. Laisser 5 min à sec puis recouvrir
doucement avec du MMR 0,1X (ceci correspond à votre T=0). Laisser sur la paillasse et
observer les conséquences de la fécondation. Noter le moment d’apparition des changements
morphologiques qui indiquent que la fécondation in vitro a marché et noter l’ordre
chronologique de ces changements. Calculer le taux de réussite de votre fécondation in vitro.
2. Les embryons sont entourés d’une gangue, qu’il faut enlever pour la suite des expériences.
A t=30 minutes, remplacer la solution d’eau par la solution de cystéine 3%. Laisser agir
pendant 2 à 5 min en agitant doucement. Quand les embryons se touchent, vérifier sous la
loupe binoculaire la disparition de la gangue et rincer la boite avec de l’eau (3-4 lavages).
Recouvrir enfin les embryons de MMR 0.1X. Comment cette solution de cystéine peut-elle
éliminer la gangue de l’embryon ?
3. Observer les premières phases de développement embryonnaire. En particulier, noter les
plans de division et identifier les différents blastomères de l’embryon. Calculer le pourcentage
d’embryons qui se sont développés.

2.3 Effet des facteurs environnementaux sur le développement du xénope
Il est possible de déterminer le stade embryonnaire des embryons de xénope au cours de leur
développement par des critères morphologiques externes regroupés dans les tables de
Nieuwkoop et Faber (Nomal table of Xenopus laevis (Daudin) 1994) (Figure 10).
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1. Placer des embryons (7 à 10), en prenant soin de noter leur stade embryonnaire, dans 3
boites de 30 mm contenant du milieu MMR 0,1X additionné de gentamycine (50µg/ml) que
vous allez placer à différentes températures (12ºC, 24-25ºC et à température ambiante).
N’oublier pas de noter la température de la salle TP au début et à chaque séance.
2. Observer les embryons des 3 boîtes au cours des deux séances suivantes. A quels stades se
trouvent les embryons incubés à différentes températures après 24 heures et 48 heures de
culture? A quelle phase du développement embryonnaire correspondent ces stades ? Conclure
quant aux effets de la température sur le développement embryonnaire du xénope.
2.4 Perturbations de la mise en place de l’axe des embryons
Il est possible d’altérer la mise en place de l’axe embryonnaire en traitant les embryons soit
par un choc thermique (4°C) ou par un traitement au chlorure de lithium (LiCl). Les embryons
manipulés sont analysés par rapport à des embryons contrôles en utilisant le DAI index
(Figure 11). Le LiCl inhibe la GSK-3 kinase, protéine impliquée dans la voie de signalisation
Wnt (faire le lien avec le cours).
1. Choc thermique : 45, 60 ou 75 min après la fécondation, placer 15-17 embryons pendant
5 min sur la glace dans une solution de MMR 0,1X préalablement refroidie à 4ºC. Les
embryons sont ensuite réchauffés progressivement en les plaçant dans l’incubateur à 12ºC,
mis en culture dans du MMR 0.1X en présence de Gentamycine à 23-24°C jusqu’au jour 3.
Observer les embryons qui ont subi le choc thermique par rapport à des embryons contrôles.
Comparer les différentes conditions. Identifier les différents index DAI des embryons et
indiquer le pourcentage d’embryons présentant ces index DAI. Conclure quant au processus
qui a été altéré par ce choc thermique.
2. Traitement LiCL : Placer 15-17 embryons au stade 32 cellules (soit T=3h si les embryons
sont placés à 23°C) dans une solution de 0,3M LiCl pendant 3, 6, 9 min puis en culture dans
du MMR 0,1X en présence de Gentamycine à 23-24°C jusqu’au jour 3.
Observer les embryons qui ont subi le traitement par rapport à des embryons contrôles.
Comparer les différentes conditions. Identifier les différents index DAI des embryons et
indiquer le pourcentage d’embryons présentant ces index DAI. Conclure en expliquant ces
résultats.
2.5 Lignage cellulaire (expérience déjà effectuée, résultats à analyser)
On peut réaliser des micro-injections à différents stades (soit stade 1, 2, 3, 4, 5) dans un
blastomère précis (Figure 12) afin de cibler une région, un tissu de l’embryon puisque le
devenir des blastomères est connu (lien avec le cours). Celles-ci sont réalisées en injectant des
ARNm dit traceurs, comme les ARNm codant la GFP et observation de la fluorescence soit
les ARNm Lac Z codant la ß-galactosidase et révélation in situ de son activité enzymatique.

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Afin que vous puissiez analyser les résultats de cette expérience, vous devez , avant de venir
en TP, consulter le site Xenbase (http://www.xenbase.org/anatomy/static/xenbasefate.jsp) et
noter le devenir cellulaire de chaque blastomère d’un embryon au stade 16 cellules.
Un blastomère particulier a été microinjecté avec l’ARNm Lac Z au stade 4 (8 cellules) et les
embryons fixés en fin d’organogenèse. L’activité ß-galactosidase a été révélée par ajout du
substrat X-Gal dans la solution de coloration.
Observer les embryons colorés. Comment apparaît cette coloration bleue ? Indiquer la
localisation du marquage par rapport aux axes de polarité de l’embryon. Indiquer quel(s)
tissu(s) est (sont) marqué(s) par la coloration. Identifier quel blastomère a été injecté au stade
4 (8 cellules).

2.6. Inductions dans les calottes animales (« animal cap assay »)
Pour réaliser cette expérience lors de la seconde séance, il est nécessaire de placer des
embryons (environ 10 à 15 par binôme) à 12°C à la fin de la première séance de TP.
1. Préparation de la plaque de milieux (1 plaque de 12 puits par groupe de TP). Plusieurs
conditions sont réalisées afin de tester les effets de l’Activine A et du FGF (ajoutés dans le
milieu à savoir MMR 0,75X + Gentamycine (50µg/ml) + BSA (0,1%)) sur le devenir de ces
cellules du pole animal :
− Lots traités avec Activine A (10ng/ml et 50ng/ml)
− Lots traités avec FGF (50ng/ml et 100ng/ml)
− Lot contrôle (milieu seul).
Les Solutions Stock sont les suivantes :
− Activine A: 25ng/µl (1 aliquot de 10µl)
− FGF: 100ng/µl (1 aliquot de 10µl)
− Gentamycine : 50mg/ml
− BSA : 30%
− MMR : MMR1X
Calculer les dilutions et volumes de chaque réactif de cette expérience sachant que 1 ml est
placé dans chaque puits (il faut 2 puits par condition car on effectue l’expérience en
duplicate).
Les volumes doivent pouvoir être prélevés avec les pipettes fournies en TP.

2. Placer les embryons au stade blastula (stade 8 ou 9) dans une boite de 60 mm dont le fond a
été recouvert d’agarose 1% dans une solution de MMR 0,75X.
2. Enlever la membrane vitelline des embryons à l’aide des pinces ultrafines.

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3. Découper l’animal cap (renfermant 50 à 100 cellules) avec les pinces fines. Le retourner
délicatement de telle manière que l’ectoderme soit face à l’agarose. Les calottes animales sont
ensuite placées dans les puits de la plaque de 12 puits et cultivées jusqu’au lendemain à
température ambiante.
Prévoir des embryons contrôles pour identifier le stade de développement le lendemain (à
placer dans une solution de MMR 0.1X en présence de Gentamycine).
4. Observer le lendemain (3ème séance de TP) la morphologie des « animal cap » de chaque
condition.
5. Observer les lames placées sous le microscope : ce sont des coupes d’animal cap traité avec
de l’Activine A (lames notées A), FGF (lames notées F) ou contrôles (lames notées C)).
Quelles sont vos observations ? Quelles cellules/tissus ont été induits par cette expérience ?
Que pouvez-vous conclure sur les cellules de la calotte animale?
Conclure quant aux effets de ces 2 facteurs.

3. Annexes :
Composition Milieux de culture
- HSB (High Salt Buffer) 1X:
108 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 2,5 mM NaHCO3 , 5 mM
Hepes (pH7.8)
- MMR (Marc's Modified Ringer's) 1X:
100 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM Hepes (pH7.8)
- OR2 (sans calcium):
82.5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM MgCl2, and 5 mM Hepes, pH 7.4

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Figure 10 : Tables de Nieuwkoop and Faber (1967)

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Figure 11

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Figure 12

Ref : Xenbase website : http://www.xenbase.org/common/

1 division cellulaire

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Figure 13

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Figure 14

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Figure 15

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