cours epissage CEG

Contrôle de l'expression génétique :

Les régulations post-transcriptionnelles

L'ARNm, simple intermédiaire entre le génome et les protéines ?

gène

protéine

L'ARNm, simple intermédiaire entre le génome et les protéines ?

gène

protéine
pré-ARNm

ARNm

ARNm

L'ARNm, simple intermédiaire entre le génome et les protéines ?

gène

protéine

épissage
pré-ARNm

ARNm

stabilité

ARNm
localisation

transport

traductibilité

Vue "classique" de l'expression génétique

Vue "contemporaine" de l'expression génétique

Contrôle du métabolisme des ARNm

Le métabolisme des ARNm est contrôlé par
deux grandes familles de facteurs :

- Les protéines de liaison aux ARNm (RNA-BP)
- Les ARN micro (miRNA)

Les protéines de liaison aux ARN

Les protéines de liaison aux ARN
se lient à des séquences régulatrices
présentes sur le pré-ARNm ou l'ARNm
et servent d'adaptateurs aux différentes
machineries contrôlant le métabolisme
Des ARN.

Formation de complexes mRNP
hautement dynamiques

Les protéines de liaison aux ARN

Les protéines de liaison aux ARN
- Les protéines à domaines RRM (RNA Recognition Motif) ou RBD (RNA Binding Domain)
Caractéristiques : 80 à 90 acides aminés avec deux motifs très conservés appelés
RNP1 (R/K-G-F/Y-G/A-F/Y-V-X- F/Y) et RNP2 (L/I- F/Y-V/L-G/K-G/N-L)
1 à 5 domaines par protéine
Structure :

1 feuillet β formé de 4 chaînes antiparallèles (β4 β1 β3 β2)
+ 2 hélices α
Topologie : βαββαβ

ARN cibles :

ARN simples brins, tiges boucles, boucles internes

Les protéines de liaison aux ARN
- Les protéines à domaines RRM (RNA Recognition Motif) ou RBD (RNA Binding Domain)
Caractéristiques : 80 à 90 acides aminés avec deux motifs très conservés appelés
RNP1 (R/K-G-F/Y-G/A-F/Y-V-X- F/Y) et RNP2 (L/I- F/Y-V/L-G/K-G/N-L)
1 à 5 domaines par protéine
Structure :

1 feuillet β formé de 4 chaînes antiparallèles (β4 β1 β3 β2)
+ 2 hélices α
Topologie : βαββαβ

ARN cibles :

ARN simples brins, tiges boucles, boucles internes

Les protéines de liaison aux ARN
- Les protéines à domaines KH (hnRNP K homologue)

Caractéristiques : 60 à 70 acides aminés avec un motif très conservé : V I G X X G X X I
1 à 10 domaines par protéine

Structure :

1 feuillet β formé de 3 chaînes antiparallèles + 3 hélices α
Topologie : βααββα

ARN cibles :

ARN simples brins

Les protéines de liaison aux ARN
- Les protéines à domaines Ds-RBD (Double strand RNA Binding Domain)
Caractéristiques : Environ 70 acides aminés

Structure :

1 feuillet β formé de trois chaînes antiparallèles + 2 hélices α
Topologie : αβββα

ARN cibles :

ARN partiellement ou complètement doubles brins

Maturation différentielle
du pré-ARNm :
l'épissage alternatif

Maturation du pré-ARNm
ADN génomique
transcription

polyadénylation

pré-ARNm
AUG

exon

coiffe

intron

coiffage

stop

exon

(A)n

épissage
AUG

stop

ARNm coiffe

(A)n

export
NOYAU
CYTOPLASME

AUG

stop

coiffe

(A)n

traduction

proteine

dégradation

I. Rappels sur la maturation du pré-ARNm

A. Le coiffage

Rappels sur la maturation du pré-ARNm

Complexe de clivage

B. La polyadénylation

AAUAAA

Site de clivage
CA

U/GU-riche

Site de
Clivage
10-30 nt
≤30 nt
5’

USE
Riche en U

AAUAAA
Hautement
conservée

Clivage

Site poly(A)

DSE

CA

Riche en U
et GU

Aux DSE

AAUAAA

3’

U/GU-riche

Dégradation

Addition de la queue
poly(A)
AAUAAA

Rappels sur la maturation du pré-ARNm

C. L’Epissage
SR

exon

GU
site 5’

S. Cerevisiae
Vertébrés

exon

intron

GUAUGU
GUA A G U
(GURAGU)

AG
séquence
site 3’
Site de
branchement polypyrimidine

UACUAAC
CCC U GA C
(YNCURAY)

Réalisé au sein d'un complexe ribonucléoprotéique :
Comprend :
- 5 ARNsn : U1, U2, U4, U5, U6 associés à des protéines pour former
les snRNP U1, U2, U5 et la disnRNP U4/U6.

Rappels sur la maturation du pré-ARNm

L’Epissage
SR

exon

GU
site 5’

S. Cerevisiae
Vertébrés

exon

intron

GUAUGU
GUA A G U
(GURAGU)

AG
séquence
site 3’
Site de
branchement polypyrimidine

UACUAAC
CCC U GA C
(YNCURAY)

Réalisé au sein d'un complexe ribonucléoprotéique : le splicéosome
Comprend :
- 5 ARNsn : U1, U2, U4, U5, U6 associés à des protéines pour former
les snRNP U1, U2, U5 et la disnRNP U4/U6.

Rappels sur la maturation du pré-ARNm

snRNP U1

Rappels sur la maturation du pré-ARNm

L’Epissage
SR

exon

GU
site 5’

S. Cerevisiae
Vertébrés

exon

intron

GUAUGU
GUA A G U
(GURAGU)

AG
séquence
site 3’
Site de
branchement polypyrimidine

UACUAAC
CCC U GA C
(YNCURAY)

Réalisé au sein d'un complexe ribonucléoprotéique : le splicéosome
Comprend :
- 5 ARNsn : U1, U2, U4, U5, U6 associés à des protéines pour former
les snRNP U1, U2, U5 et la disnRNP U4/U6.
- Une centaine de protéines différentes = facteurs d'épissage.

Rappels sur la maturation du pré-ARNm
complexe E

complexe A

(+ATP)

complexe B

(+ATP)

Mise en place séquentielle
du spliceosome

1ère réaction de transestérification

complexe C (+ATP)

Rappels sur la maturation du pré-ARNm
complexe E

complexe A

(+ATP)

complexe B

(+ATP)

Mise en place séquentielle
du spliceosome

2ème réaction de transestérification

complexe C (+ATP)

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage

intron

GU
site 5’

S. Cerevisiae
Vertébrés

GUAUGU
GUA A G U
(GURAGU)

AG
séquence
site 3’
Site de
branchement polypyrimidine

UACUAAC
CCC U GA C
(YNCURAY)

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage

5' 3'

5'

3'

5' 3'3'

5' 5'

5'

3'

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage

U2

U1

U1

U2

U1
U1
U2

U1

5' 3'

U2

5'

3'

U1

5' 3'3'

U1

U2
U2

U1

U2

5' 5'

U2

5'

3'

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage
U2

U1
U2

5' 3'
U1

U1

5'
U1

3'

U1

U2
U2
U2

5' 3'3'
U1

U1

U2

U2

5' 5'

5'

U1 U1

U1

3'

Reconnaissances des sites 5' et 3' d'épissage
U1

U2

U1
U1

U2

U1

5' 3'
U1

U2

5'
U1

3'
U2

5' 3'3'
U1

U2

U2

5' 5'

5'

3'

U1 U1

U1

U2

Définition intronique versus définition exonique

SR
70K

U1

U2

65

U2AF

ex 5’

U2

35

ex 3’

Définition intronique
- levure
- drosophile

65

35

U2AF

70K
SR
SR U1

Définition exonique
- vertébrés

Définition intronique versus définition exonique

Définition intronique

SR

U1

U2

3'

5'

U2

3'

U2

3'

Définition intronique versus définition exonique

Définition intronique

SR

U2

U2

U1

3'

5'

U2

3'

3'

Définition intronique versus définition exonique

Définition intronique

SR

U1

U2

5'

3'

3'

3'

Définition exonique
SR

U2

3'

U2

U1

3'

5'

U2

3'

Définition intronique versus définition exonique

Définition intronique

SR

U1

5'

3'

U2

U2

3'

3'

Définition exonique
SR

U2

U2
U2

3'

U1

3'

5'

3'

Définition intronique versus définition exonique

Définition intronique

SR

U1

U2

5'

3'

3'

3'

Définition exonique
SR

U2
U2

3'

U1

3'

5'

3'

Définition exonique des exons terminaux

Exon 5' terminal

Exon interne

Exon 3' terminal

II. L'épissage alternatif

Définitions :
Epissage alternatif : sélection différentielle de sites d'épissages
fonctionnels à l'intérieur d'un même pré-ARNm

Polyadénylation alternative : sélection différentielle de signaux
de polyadénylation fonctionnels à l'intérieur d'un même pré-ARNm

A. Les différents évènements d’épissage alternatifs

exon cassette

exons mutuellement exclusifs

site 5' alternatif

site 3' alternatif

intron alternatif

Plusieurs groupes d'exons alternatifs
peuvent être présents dans un préARNm

12 X 48 X 33 X 2 = 38000 combinaisons théoriques !

B. Les différents évènements de polyadénylation alternative
pA1
AUG

pA2

stop

1

Signaux de polyadénylation en tandem

2

pA1
AUG

pA2
stop

stop

1

pA1
AUG

1

Exons 3' terminaux alternatifs

3

2

stop

2
site 5'

2'

pA2
stop

3

Exon composite interne/terminal

C. Prévalence de l’épissage alternatif

Trois méthodes pour l'étudier :

1. Analyse et comparaison des séquences EST

2. Analyse de puces ADN dédiées à l'épissage

3. Séquençage massif des ARNm présents dans différents tissus

C. Prévalence de l’épissage alternatif

1. Analyse et comparaison des séquences EST

Séquence EST : Expressed Sequence Tag :
Séquence partielle d'un ADNc issue d'un séquençage massif
et systématique des clones contenus dans une banque ADNc

5'

3'

Les séquences EST sont représentatives de
l'expression d'un gène dans un tissu donné.

C. Prévalence de l’épissage alternatif

EST muscle squelettique

EST cerveau

1°) comparaison des séquences EST entre elles

C. Prévalence de l’épissage alternatif
2°) comparaison des séquences EST avec le génome

Muscle
squelettique

Cerveau

C. Prévalence de l’épissage alternatif
2. Analyse de puces ADN dédiées à l'épissage
Rappels puces à ADN

Les niveaux d'expression de milliers de gènes dans une cellule peuvent
être déterminés en mesurant la quantité d'ADN lié sur chaque site

C. Prévalence de l’épissage alternatif

Utilisation de puces avec des séquences qui correspondent
aux exons et aux différentes combinaisons de jonctions

C. Prévalence de l’épissage alternatif

3. Séquençage massif des ARNm présents dans différents tissus
Séquenceurs de nouvelles générations
454

1 million de séquences (500 pb) par run

Solexa > 100 millions de séquences (30 pb) par run
Solid > 100 millions de séquences (30 pb) par run

C. Prévalence de l’épissage alternatif

alignement sur le génome ou un transcriptome de référence

C. Prévalence de l’épissage alternatif

alignement des "reads" sur le génome ou un transcriptome de référence
Tissu 1

Tissu 2

C. Prévalence de l’épissage alternatif

Chez l'homme ?? % des gènes avec plusieurs exons
produisent des transcrits alternatifs.

Références :
A Global View of Gene Activity and Alternative Splicing by
Deep Sequencing of the Human Transcriptome
Marc Sultan et al. Sciences 2008 321 pp. 956-960

Deep surveying of alternative splicing complexity in the human
transcriptome by high-throughput sequencing.
Pan Q et al. Nat. Genet. 2008;40 pp 413-1415,

C. Prévalence de l’épissage alternatif

Chez l'homme 95 % des gènes avec plusieurs exons
produisent des transcrits alternatifs.

Références :
A Global View of Gene Activity and Alternative Splicing by
Deep Sequencing of the Human Transcriptome
Marc Sultan et al. Sciences 2008 321 pp. 956-960

Deep surveying of alternative splicing complexity in the human
transcriptome by high-throughput sequencing.
Pan Q et al. Nat. Genet. 2008;40 pp 413-1415,